[发明专利]一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌，其特征在于，所述重组菌过表达突变的乙醇脱氢酶基因adhE和聚酮合酶基因phlD，宿主菌为大肠杆菌；所述乙醇脱氢酶基因adhE来源于大肠杆菌（Escherichia coli）,Genbank 登录号为945837；所述突变的乙醇脱氢酶基因adhE其编码的氨基酸第267位由丙氨酸突变为苏氨酸，记为A267T；第568位由谷氨酸突变为赖氨酸，记为E568K；所述聚酮合酶基因phlD来源于荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens），Genbank 登录号为3480329。

2.权利要求1所述的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1）克隆获得乙醇脱氢酶基因adhE，将267位的丙氨酸突变为苏氨酸，568位的谷氨酸突变为赖氨酸，得到突变的乙醇脱氢酶基因adhE；克隆获得聚酮合酶基因phlD；

2）将步骤1）得到突变的乙醇脱氢酶基因adhE连接到质粒载体，获得重组质粒I；

3）将步骤1）所得的聚酮合酶基因phlD连接到质粒载体，获得重组质粒II；

4）将步骤2）所得的重组质粒I和步骤3）所得的重组质粒II同时导入到宿主细胞，获得重组菌。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤2）所述质粒载体，为质粒pACYCDuet-1。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤3）所述质粒载体，为质粒pET28a。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

1）以大肠杆菌基因组DNA为模板，设计引物克隆乙醇脱氢酶基因adhE；以荧光假单胞菌基因组为模板，设计引物克隆聚酮合酶基因phlD；

2）将步骤1）所得的乙醇脱氢酶基因连接到质粒pACYCDuet-1，获得重组质粒pACYCDuet-adhE，以重组质粒pACYCDuet-adhE作为模板，利用定点突变试剂盒突变adhE两个关键位点A267T和E568K，获得带有突变位点的重组质粒记为：pACYCDuet-adhE（A267T,E568K）；

3）将步骤1）所得的聚酮合酶基因phlD连接到质粒载体pET28a，获得重组质粒pET28a-phlD；

4）将步骤2）所得的重组质粒pACYCDuet-adhE（A267T,E568K）和步骤3）所得的重组质粒pET28a-phlD同时导入受体细胞E.coli W3110，获得重组菌ZG-3433。

6.权利要求1所述重组菌在发酵生产间苯三酚中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述生产间苯三酚步骤如下：

1）活化权利要求1所述的重组菌，获得活化重组菌；

2）将步骤1）所得的活化重组菌接种到含有卡那霉素和氯霉素的柠檬酸铁铵液体培养基中进行发酵培养。