[发明专利]鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备方法

权利要求书

1.一种鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备方法，其特征在于：选取三种基础毒种利用易感鸭胚分别制得免疫原抗原，然后按比例配制呈油乳佐剂免疫原，对未经免疫的健康产蛋鸡进行免疫接种，收集高免蛋，并从其蛋黄中提取鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体。

2.根据权利要求1所述的一种鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)免疫原抗原的制备

病毒的增殖：将(1型SD株+3型GQ株)鸭病毒性肝炎病毒毒株和鸭大舌病病毒毒株分别用灭菌生理盐水稀释至200ELD₅₀/0.1ml，经尿囊腔分别接种10-11日龄易感鸭胚，每胚0.1-0.2ml，置37℃孵育24小时，照胚弃去24小时内的死胚；对接种24小时后的鸭胚，每4小时照胚一次，将死亡胚放2-8℃冰箱；收集24-120小时死亡鸭胚的尿囊液及胚体，匀浆后，反复冻融2次，再以4200r/min离心20-30分钟，收集上清液，分别定量分装于无菌安培瓶中，注明收获日期、毒种代次，冷冻保存备用；

接种：用灭菌生理盐水将增殖所得三种病毒毒种分别稀释10³-10⁵倍，经尿囊腔接种10-11日龄易感鸭胚，每胚0.1-0.2ml，封孔后，置36-37℃继续孵育120小时，不必翻蛋；

孵育：接种后24小时开始照胚，弃去24小时内的死胚，之后每4小时照胚一次，24-120小时死亡的鸭胚随时取出，置于2-8℃冷却12-24小时；

收获：将冷却的鸭胚取出，用碘酊消毒气室部位，无菌收集典型病变鸭胚的尿囊液和胎儿，收集时逐个检查胚胎病变，凡胎儿腐败、胚液浑浊或胎儿无鸭甲型肝炎病毒或鸭大舌病所引起的特征性病变者，弃去不用；每个毒种的5-8枚鸭胚的尿囊液和胎儿混为1组，匀浆后反复冻融2次，再以4200r/min离心30分钟，分别取三种病毒上清液置于灭菌容器内，记为A即鸭肝炎1型病毒液、B即鸭肝炎3型病毒液、C即鸭大舌病毒液，均置于-20℃保存备用。

病毒液灭活：将ABC三种病毒液分别加入10％的甲醛溶液，随加随摇使其充分混合，使甲醛溶液的终浓度为0.1％，37℃条件下灭活24小时，期间每4小时摇晃一次，灭活完毕，灭活后的病毒液置2～8℃保存，有效期为30日；

(2)油乳佐剂免疫原的配制：

油相制备：10号白油94份、司本-806份、硬脂酸铝2％，硬脂酸铝与少量白油混合加热溶化后，再加入司本-80充分搅拌，补足白油，混匀后分装，116℃30分钟灭菌后备用；

水相制备：将鸭肝炎病毒SD株、鸭肝炎病毒GQ株及鸭大舌病抗原按(v/v/v)1:1:1比例配置的灭活病毒液96份、吐温-804份，吐温-80事先加入带玻璃珠的瓶中灭菌，然后加入少量步骤(1)中所得灭活病毒液，震荡使吐温-80完全溶解；最后加入余下的灭活病毒液，充分震荡混匀；

配比：按油相与水相3:2(v/v)的比例进行配制，先取3份油相置组织捣碎机内，慢速搅拌的同时缓缓加入2份水相，加完后再以10000r/min搅拌5-8分钟，使混合物充分乳化；乳化后，取样10ml，以3000r/min离心15分钟，如不分层，终止搅拌，无菌操作分装至250ml无菌玻璃瓶中得(1型+3型)鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联病毒油乳佐剂免疫原D，并在玻璃瓶外壁注明名称、制备时间、装量等；

(3)高免蛋生产与收集

高免蛋的生产：选择健康的未经免疫的产蛋鸡，用步骤(2)中配比后所得(1型+3型)鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联病毒油乳佐剂免疫原D对鸡群进行产蛋前免疫，包括基础免疫、加强免疫、强化免疫、维持免疫；

高免蛋收集：强化免疫接种后，从第14日开始，每隔3日抽样高免蛋，按蛋黄与灭菌生理盐水1:3(v/v)稀释，加入与原蛋黄等体积的三氯甲烷，充分振摇，离心分离上清液，即为待测样品E，当三种病毒毒株抗体效价达到一定数值，即为高免蛋最佳收集时间，且收集的高免蛋于10～15℃环境中，放置时间应不超过10日；

(4)卵黄抗体的制备

蛋壳消毒：清洗干净步骤(3)中收集的高免蛋，然后将其浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15分钟，取出晾干后，再用环氧乙烷气雾消毒30分钟；

蛋黄分离：采取手工打蛋或机械打蛋，打蛋时应充分取出蛋清(白)、胚盘和系带，收集蛋黄；将收集的蛋黄充分搅拌，使蛋黄呈均匀膏状，加入与蛋黄等体积的灭菌注射水，搅拌混匀后，60-65℃保温(灭活)30分钟；

酸化萃取：向无菌的酸化罐中先加入蛋黄体积6倍的酸化用水(预先用无水乙酸钠及冰乙酸制备，pH值5.0，冷却至4℃)；然后，倒入蛋黄分离并灭活后的蛋黄液、边加边搅拌，待蛋黄液的温度降至4℃时，保温静置2-4小时；酸化完成后，离心取上清液，然后向上清液中加入终浓度为0.1％的正辛酸做灭活剂和萃提剂，搅拌，室温放置2-6小时；

浓缩：将加辛酸处理好的卵黄液用孔径5μm和1μm的筒式滤芯过滤，再用截留分子量为10kD的中空纤维超滤柱进行浓缩3-4倍，用NaOH调整浓缩液PH值至6.8-7.2，用0.45μm和0.22μm筒式滤芯进行过滤除菌后，按终浓度为0.1％加入甲醛溶液，充分搅拌均匀，密闭灭活2小时后定量分装，加盖密封，2-8℃保存，即得鸭病毒性肝炎、鸭大舌病二联多价卵黄抗体。