[发明专利]抗体FcRn结合的修饰

权利要求书

1.一种用于提供具有改善的体内半衰期的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

a) 确定 FcRn 亲和色谱法中亲本抗体的相对保留时间，

b) 通过引入增强 Fc 区与人 FcRn 的结合的突变来修饰所述抗体的 Fc 区，以获得经修饰的抗体，

c) 确定 FcRn 亲和色谱法中所述经修饰的抗体的相对保留时间，

d) 如果所述亲本抗体与所述经修饰的抗体之间的所述相对保留时间的变化小于 1分钟以及大于 5 分钟，则重复步骤 b)，其中在所述相对保留时间的变化小于 1 分钟的情况下选择导致所述 Fc 区与人 FcRn 的结合进一步增强的突变，或者在所述相对保留时间的变化大于 5 分钟的情况下选择导致所述 Fc 区与人 FcRn 的结合较少增强的突变，

e) 用所述亲本抗体和所述经修饰的抗体执行具有正线性 pH 梯度的 FcRn 亲和色谱法和具有正线性电导率/盐梯度的肝素亲和色谱法，

以及

f) 如果所述经修饰的抗体具有以下特征，则提供具有改善的体内半衰期的抗体

i)在所述FcRn 亲和色谱柱上的相对保留时间小于在相同洗脱条件下所述亲本抗体在相同FcRn 亲和色谱柱上的保留时间，或

ii)在所述肝素亲和色谱柱上的相对保留时间小于在相同洗脱条件下所述亲本抗体在相同肝素亲和色谱柱上的保留时间，或

iii) i) 和 ii) 两者。

2.根据权利要求 1 所述的方法，其中所述亲本抗体与所述经修饰的抗t体之间的所述相对保留时间的变化大于 2 分钟且小于 4.5 分钟。

3.根据权利要求 1 至 2 中任一项所述的方法，其中所述亲本抗体与所述经修饰的抗体之间的所述相对保留时间的变化大于 3 分钟且小于 4 分钟。

4.根据权利要求 1 至 2 中任一项所述的方法，其中所述 FcRn 亲和色谱法执行如下：

将 FcRn 亲和色谱柱用 80 vol-% 缓冲液 A和 20 vol-% 缓冲液 B在 0.5 mL/min流速和 25℃ 柱温下平衡，所述 FcRn 亲和色谱柱包含 1 mL 的链霉亲和素琼脂糖基质，所述链霉亲和素琼脂糖基质经由生物素-链霉亲和素非共价相互作用与人 FcRn 缀合；

在 80 vol-% 缓冲液 A 和 20 vol-% 缓冲液 B 的相同混合物中配制总共 30 µg 所述抗体，并将所述抗体注射到经平衡的柱上；

注射后十分钟，开始历经 70 分钟的从 20 vol-% 至 100 vol-% 缓冲液 B 的线性梯度；

在用 80 vol-% 缓冲液 A 和 20 vol-% 缓冲液 B 重新平衡所述柱之前，任选地将100 vol-% 缓冲液 B 保持 10 分钟；

其中缓冲液 A为：20 mM MES 钠盐，140 mM NaCl，pH 5.5；缓冲液B为：20 mM Tris/HCl，140 mM NaCl，pH 8.8；

其中用设置在 280 nm 的 UV 检测器执行检测；

其中，为了使来自不同运行以及不同缓冲液和柱批次的结果具有可比性，并且为了补偿轻微的保留时间偏移，在每个序发事件的开始和结束以及每第 10 次运行后测量标准样品，根据以下方程式计算在所述 FcRn 亲和色谱柱上的相对保留时间：

其中 t_rel,i：峰 i 的相对保留时间；t_i：峰 i 的保留时间；t_peak2：部分氧化的抗 Her3抗体的第二峰的保留时间；t_peak3：在 FcRn 亲和色谱柱上的部分氧化的抗 Her3 抗体的第三峰的保留时间，其梯度如本项权利要求在前文所概述。

5.根据权利要求4所述的方法，其中每 g 基质具有1 mg至5 mg FcRn。

6.根据权利要求5所述的方法，其中每 g 基质具有2.5 mg FcRn。