[发明专利]人视网膜祖细胞分离及培养方法

权利要求书

1.一种从人样本分离初代视网膜细胞的方法，其包含：

(a)从该人样本分离包含多个初代视网膜细胞的视网膜样本，

(b)机械解离在步骤(a)分离的该视网膜样本中的所述多个初代视网膜细胞而未使用蛋白酶消化所述多个初代视网膜细胞，从而产生细胞及细胞簇的经解离的悬浮液，及

(c)测定得自所述视网膜样本的所述初代视网膜细胞的存活力、数量、及形态，其中产生至少30x10⁶个存活的初代视网膜细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述人样本为一个或一对人眼球。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述眼球具有正常形态，包含完整球体、透明角膜、正常形状、或其任何组合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前在从所述人供体收集人样本后，将所述人样本置于输送细胞培养基中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述输送细胞培养基包括含有L-谷氨酰胺的RPMI-1640或Advanced DMEM/F12。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述输送细胞培养基包含约0.5至50微克/毫升的庆大霉素，任选地其中所述输送细胞培养基包含50微克/毫升的庆大霉素。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述人样本在置放于所述输送细胞培养基中之后立即储存在约1至8℃。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述人样本是在从所述人供体收集后约7至约26小时内使用。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤(a)中从所述人样本分离所述视网膜样本包括：

(i)从所述输送培养基移出所述一个或一对人眼球，

(ii)用约1-8℃补充抗生素的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗所述一个或一对人眼球，

(iii)从所述一个或一对人眼球移出视神经及间质组织，

(iv)用约1-8℃补充抗生素的PBS洗涤所述一个或一对人眼球，

(v)使用针在角膜缘穿刺所述一个或一对人眼球的每一个的球体，

(vi)沿所述一个或一对人眼球的角膜缘周向切割，

(vii)从所述一个或一对人眼球移出晶状体、角膜及相连的玻璃体，

(viii)从视网膜色素上皮(RPE)层解离视网膜以产生经分离的视网膜或一对经分离的视网膜，及

(ix)将所述经分离的视网膜或所述对经分离的视网膜置于约1-8℃的培养基或PBS中，其中所述培养基或PBS补充有抗生素。

10.根据权利要求9所述的方法，其中重复步骤(ii)1-5次或3次。

11.根据权利要求9或10所述的方法，其中步骤(iii)移出一些或所有眼外组织及细胞。

12.根据权利要求1-11任一项所述的方法，其中步骤(b)包括：

(i)将所述视网膜样本转移至试管，

(ii)机械解离所述视网膜样本以产生多个经解离的初代视网膜细胞，

(iii)经由离心使所述多个经解离的初代视网膜细胞沉淀成粒，及

(iv)移出上清液。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述视网膜的所述机械解离是经由用无菌移液管粉碎进行。

14.根据权利要求13所述的方法，其中进行所述粉碎2至50次、2至10次、或4至8次。

15.根据权利要求12-14中任一项所述的方法，其中所述多个经解离的初代视网膜细胞经由在4℃、约140xg离心约3分钟的时间段而沉淀成粒。