[发明专利]利用玻璃体切除术、眼球内注入和去除MNU的视网膜变性动物模型制作方法及利用其的视网膜变性动物模型

说明书

本发明的一实施例提供一种视网膜变性动物模型的制作方法，包括以下步骤：步骤a：对除人类以外的哺乳动物的眼球进行玻璃体切除术来去除玻璃体；步骤b：用空气置换去除了玻璃体的眼球内空的空间；步骤c：向所述眼球内空的空间注入N‑甲基‑N‑亚硝基脲(MNU，N‑methyl‑N‑nitrosourea)溶液；以及步骤d：去除MNU溶液。

技术领域

本发明涉及视网膜变性动物模型的制作方法及利用其制作的视网膜变性动物模，该视网膜变性动物模型的制作方法利用向通过玻璃体切除术去除了玻璃体组织的动物眼球内注入及去除N-甲基-N-亚硝基脲(MNU，N-methyl-N-nitrosourea)的方法。

背景技术

视网膜变性是一种由于视细胞的变性导致视力下降最终导致失明的疾病，至今尚无有效的治疗方法。为了使用治疗遗传性视网膜变性、色素性视网膜炎(retinitispigmentosa，RP)等因视网膜的视细胞损伤导致的失明疾病的基因治疗、干细胞治疗以及人造视网膜等多种治疗方法，必须开发患有视网膜变性疾病的实验动物。

为了应用上述各种治疗方法，正在开发基因变性动物模型或药物诱导变性模型。对于使用药物来诱导视网膜变性的动物模型而言，一旦确定药物变性方案，则具有以下优点：相比基因变性动物模型价格低廉；诱导变性的时间短，可以大量诱导变性；可使研究人员不受各种规则的约束。

目前，N-甲基-N-亚硝基脲(MNU，N-methyl-N-nitrosourea)是用于制作视网膜变性动物模型的药剂中一种，作为广泛存在于日常环境中的氮化合物，是能够诱导多种动物的视网膜变性的烷基化合物。MNU作为无需p-450系统(p-450system)的代谢活化就能够直接引起烷基化(alkylating)的化学物质，既是一种突变原，也是致畸物及致癌物。最为普遍的利用MNU的动物模型制作方法是在小鼠或大鼠全身注射MNU来诱导视网膜变性。一方面，众所周知，在视网膜变性模型中，MNU对视网膜感光细胞具有特异性毒性，诱发视网膜感光细胞的细胞凋亡(apoptosis)，并且，其损伤程度与MNU的用量与时间成比例。具体地，在注射MNU 24小时后，可以观察到视网膜厚度减小，在利用TUNEL染色的细胞凋亡的形态学研究中，在注射药物12小时后开始观察到细胞凋亡，在24小时后达到峰值。

另一方面，现有的利用MNU制作的视网膜变性动物模型通过全身注射使实验对象双眼失明，因此对于需要长时间饲养实验对象并观察治疗效果的研究而言存在困难。此外，在进行全身注射时，药物毒性会导致实验对象体重减轻，诱发癌症甚至死亡的问题。作为替代方案，在Rosch，S.，Werner，C.，Muller，F.等人的格来弗临床与实验眼科学文献(GraefesArch Clin Exp Ophthalmol)(2017)255:317中描述了向兔眼球直接注射MNU来诱导视网膜变性的研究，然而，其局限在于很难以兔体重为基准确定MNU注射量，并应用到实际临床中，并且，无法确定注入至眼内的药物在眼内的分布情况。

发明内容

要解决的技术问题

基于上述背景，本发明人发现利用向通过玻璃体切除术去除了玻璃体组织的眼球内注入特定浓度的MNU，并在放置规定时间后去除药物的方法，可以制作与眼球大小无关来诱导眼球整体变性的动物模型，由此完成了本发明。

本发明的目的在于解决现有技术中的问题，提供一种视网膜变性动物模型的制作方法及利用其的动物模型，其局限于一侧眼，并且，眼球内整个范围的视网膜视细胞消失。

然而，本发明要解决的技术问题并不受限于上述言及课题，未言及的其他课题将通过下面的记载由本领域普通技术人员明确理解。

解决问题的技术方法