[发明专利]用于检测微生物和病毒颗粒的方法和组合物

说明书

本发明涉及制备样品的快速、安全且准确的方法，所述样品包括微生物或病毒核酸以供扩增并且可以用于检测如埃博拉病毒等高致病性病毒的存在。所述方法涉及在存在包括溶剂和洗涤剂的试剂的情况下加热所述样品。还提供了试剂和组合物。

技术领域

本发明涉及微生物和病毒颗粒的检测，具体地粗样品中微生物或病毒颗粒的检测。

背景技术

需要例如用于微生物或病毒感染诊断的快速、简化和成本相对较低的分子诊断测试以在偏远地区需要的时候使用。一个最近的相关实例是2014年刚果金(DRC)的埃博拉病毒(Ebola)爆发以及所述地区当前正在发生的疫情。在这些环境中的关键是对患者进行快速分类的能力，使得可以将真正受到感染的患者与因如疟疾等其它原因而发热的患者隔离开来。由于如埃博拉病毒等病毒性出血热具有极强的传染性，因此在野战医院环境中迅速正确地对患者进行分层至关重要。同样重要的是绝对要求通过最小化暴露于在这种情况下通常用于分子测试的受感染患者血液来最大化操作人员的安全。病原体诊断通常是在对样品进行了核酸提取以便纯化任何靶病原体核酸后进行的，并且所述核酸提取对实验室工作人员来说是主要的危险点。因此，需要一种使用最少的实验室设施并且无需熟练的操作人员的简单、生物安全的方法。

通常，用于筛选高防护水平病原体(如埃博拉病毒)的存在的分子方法需要附加水平的生物安全性，以保护执行测试的操作人员。筛选这些病毒性出血热的第一步是从患者那里抽取静脉血。采集样品的个体通常会穿着全面的个人防护装备，包含多副手套、防护服和口罩。采集血液样品后，通过浸泡在漂白剂以及然后杀病毒剂(例如异硫氰酸胍)中来对收集容器的外部进行消毒，以在进行核酸提取之前使病毒不具传染性。这些已知方法包含多步骤程序，并且因此需要训练有素的使用者并可以进入实验室。

用于此类测试的静脉抽取液的典型体积为3-6ml，因此，考虑到必须进行多次液体转移和取下瓶盖，暴露于病原体的风险很高。如果体积较小，如可以直接处理较小体积的血液，则可以将此暴露风险降到最低。

如果要处理较小体积的样品(例如血液)，以最大程度地提高操作人员的安全性，那么灵敏度的要求就会增加。世界卫生组织研发蓝图(https://www.who.int/blueprint/en/)将3,000病毒体/ml全血的水平定义为适合发展中国家进行低成本诊断的检测水平。这将有可能检测多种疾病，包括HIV和丙型肝炎，并且包含上文所述的病毒性出血热(埃博拉病毒、拉沙热(Lassa)、马尔堡病(Marburg)、里夫特裂谷热(Rift Valley fever)、克里米亚刚果热(Crimean Congo fever)、尼帕(Nipah)、黄热病(Yellow fever)、登革热(Dengue)等)。3,000病毒体/ml的数字将提供检测下限的要求，并为直接添加到反应中所需的血液量提供指导，因为3,000/ml是每微升3个病毒靶标。

目前的方法需要改进以便于更安全地检测病原体，特别是在使用安全设备受到限制的情况下如在某些第三世界国家，这与某些最致命的病原体的高发率相吻合。

血液是通常用于诊断的潜在病原体的易于获取和常用来源。

通常经由基于PCR的诊断(包含rtPCR)检测病原体。然而，PCR典型地受到全血存在的抑制，无论是酶扩增过程和用于检测存在呈PCR某些形式如rtPCR的PCR产品的光学器件。全血含有抑制剂，如血红素、铁、免疫球蛋白和其它抑制剂，所述抑制剂会抑制进行PCR所需的聚合酶或从RNA靶标扩增所需的逆转录酶。同样，实时过程中使用的荧光团被血液中如血红素的物质淬灭，并且血液本身具有自己的吸收光谱和发射光谱，最终结果是，在高浓度的血液的存在下，实时PCR被认为是不可靠的。灵敏度的责任(特别是在使用低体积的血液时)是指，血液必须在PCR中占总反应体积的较大百分比，并且将达到由于反应不透明，因此无法再执行实时PCR的点。