[发明专利]来自假单胞菌属的非特异性核酸酶

说明书

本发明提供了包含具有用于降解核酸的非特异性核酸酶(NSN)活性的分离的多肽和阳离子络合剂如EDTA的组合物，该分离的多肽包含与SEQ ID NO:2的至少70％氨基酸序列同一性或由其组成，其中所述多肽在约4℃的溶液中具有NSN活性。所述组合物可以优选具有中性至碱性pH。还公开了包括所述组合物的试剂盒和使用所述组合物的方法。

技术领域

本发明属于酶技术领域，特别是本发明涉及在温度低至约4℃的溶液中具有活性的微生物非特异性核酸酶的应用，优选与阳离子络合剂(如EDTA)和/或中性至碱性pH结合。

背景技术

核酸酶是参与包括复制、重组、修复和限制的自然过程的核酸降解酶(Rangarajan和Shankar(2001)FEMS Microbiol Rev.25:583-613)。它们普遍存在于所有生物体中，并且定位于不同的组织和细胞亚室如细胞核和细胞器中，它们可以定位于细胞质、附着于细胞膜或分泌到细胞外。核酸酶以序列特异性(例如，限制性酶)或非序列依赖性的作用类型(非特异性核酸酶)来起作用。非特异性核酸酶(NSN)对于以非序列依赖性的方式切割、裂解、消化或降解核酸(包括基因组DNA、质粒DNA和RNA)的能力而言具有生物技术的重要性。核酸杂质是多种多样的生物技术应用(包括mRNA分离、RT-PCR、qPCR、蛋白质下游加工以及手动或自动细胞培养、分选和分离过程)不需要的对象。核酸酶根据其一级序列进行分类，并指定为不同的超家族。此外，磷脂酶D(PLD)蛋白(EC 3.1.4.4)的超家族由原核和真核PLD、磷脂酰丝氨酸合成酶、鼠类毒素和核酸酶组成。PLD家族核酸酶的分布主要限于微生物原核种类，而真核生物则呈现出显示对脂质(如磷脂酰胆碱或心磷脂)的水解活性的PLD家族的蛋白质。

Zhao等(1997，Prot.Sci.6:2655-2658)公开了一种来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(之后重命名为Salmonella enterica subsp.entericaserovar Typhimurium)的称为PLD家族的Nuc的非特异性细菌核酸酶。为了清楚起见，将这个酶在本文中命名为StNuc，以使其与其他“Nuc”核酸酶区分开。在高达1mM EDTA的存在下，StNuc能够降解双链和单链DNA。其最适pH范围为pH 5.0至6.0。在37℃下使用人工底物双(4-硝基苯基)磷酸酯时，催化速率常数k_cat确定为0.12s^-1。

Gottlin等(1998，Proc Natl Acad Sci U S A.95:9202-9207)公开了StNuc在7.0pH和30℃下对人工底物p-硝基苯基苯基膦酸酯表现出3.5s^-1的催化速率常数k_cat。这些作者进一步指出准确的测量“由于极低的酶活性而难以实现”。

Benedik和Strych(1998，FEMS Microbiol Lett.165:1-13)公开了来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的非特异性细菌核酸酶。这种酶可以依据商标从Merck购得；其手册(产品目录号70664-3)公开了该酶在pH 6.0至10.0和4℃至42℃的温度下呈现出降解RNA和DNA的活性，其中在8.0至9.2的pH范围中在37℃下达到最大活性。在1mM EDTA存在下，该酶无活性。

Song和Zhang(2008，BMC Biotechnol.8:43)公开了来自嗜热的地芽孢杆菌(Geobacillus)噬菌体GBSV1的非特异性核酸酶。其最适温度和pH分别为60℃和7.5。发现了Mn2+或Zn2+刺激该核酸酶的活性。一些酶抑制剂，如EDTA，降低酶活性。

US2009/0304668A1公开了来自公开了来自丝光绿蝇(Lucilia sericata)的幼虫排泄/分泌物，其包括在5mM EDTA存在下不被抑制的在37℃下测量的金属离子激活的DNA酶活性。