[发明专利]用于复杂基因库的PCR的多种特异性/非特异性引物

说明书

公开了用于包含复杂靶基因库的样品的单一步骤PCR的组合物和方法，其可以同时扩增样品中常见的各种各样的变体靶基因序列，同时保持基因变体的原始比率。本文描述的组合物和方法利用(1)基因特异性引物库以及(2)非特异性PCR引物，所述基因特异性引物库包含含有靶序列的复杂混合物的样品中存在的多种变体，这些都是混合物中变体扩增所需的，其可能引入扩增偏倚，所述非特异性PCR引物被设计为靶向多种基因特异性引物变体，并且消除扩增偏倚。

技术领域

本文公开了可用于进行复杂靶基因库例如微生物组样品的单一步骤聚合酶链式反应(PCR)的组合物和方法，其使用特异性和非特异性引物来扩增靶序列，同时保持基因变体的原始比率并且减少或消除引物浓度依赖性PCR扩增偏倚(amplification bias)。

背景技术

研究微生物组涉及对存在的微生物的类型进行分类以及每种类型有多少种。16S、18S、23S、内部转录间隔区(ITS)或者保守和可变遗传区的其他组合的靶向测序可用于鉴定复杂混合物中的微生物。大多数靶向区包含存在于生命的许多结构域中的保守序列，这些序列可以被PCR引物靶向，这些引物位于特定生物体特有的保守性较差的可变区的侧翼，从而对该生物体提供阳性鉴定。PCR测定具有的优势在于，用于微生物组分析所需的测序量可以比完整微生物组测序所需的测序量少几个数量级。使用16S、23S或其他靶向DNA测序技术的PCR测定典型地涉及设计在靶基因的保守区退火的引物。尽管引物位点可能是保守的，但生物体之间存在足够的变异，使得单一引物组典型地无法捕获所有变体基因。由于引物序列与变体基因的退火较差，因此生物体不是表示很差就是会表示缺失。可以通过包括与变体退火的额外引物来解决微生物变体表示缺失的问题(Apprill,A.,et al,Aquat MicrobEcol,2015and Caporaso,J.G.et al.,PNAS,2011)，但是此种方法可能会导致依赖于靶标和PCR引物的相对丰度的差异扩增(Castelino,Madhura et al.“Optimisation ofMethods for Bacterial Skin Microbiome Investigation:Primer Selection andComparison of the 454versus MiSeq Platform.”BMC Microbiology 17(2017):23.PMC.Web.11Feb.2018)，引入了PCR偏倚。为了阐明，在包含多个靶标的PCR反应中，高丰度靶标将比低丰度靶标更快地耗尽其相应的引物，并且随着反应的进行，耗尽的引物将导致该靶标的PCR效率更低。低丰度靶标将不会以相同的速率经历引物耗尽，因此低丰度PCR在更长时间中保持有效。PCR期间引物耗尽的结果是，靶基因(表示生物体)的原始种群比率将失真，人为地增大了微生物混合物中生物体的表示的低丰度和/或抑制了高丰度，这会使微生物组数据的解释显著复杂化。

可以通过包括PCR引物变体来解决缺失微生物变体的问题，但这引入了引物浓度依赖性PCR扩增偏倚的新问题。

本文公开的组合物和方法在同一PCR反应中利用特异性和非特异性引物以与起始样品中存在的靶序列的水平成比例的比率扩增靶序列，从而减少或消除了引物浓度依赖性PCR扩增偏倚的问题，同时仍然捕获包含复杂靶基因库的样品诸如微生物组中的变体。

发明内容