[发明专利]用于复杂基因库的PCR的多种特异性/非特异性引物

权利要求书

1.一种用于确定样品中靶DNA序列比率的多引物测定法，包括：

(a)在单一容器中使所述样品与多种寡核苷酸引物接触，其中，所述多种寡核苷酸引物包括：

(i)一组或多组正向和反向特异性引物，所述一组或多组正向和反向特异性引物具有被设计为不与所述样品中的DNA序列退火的非特异性核苷酸序列，所述非特异性核苷酸序列连接至与靶DNA序列的特异性连续碱基序列互补的特异性核苷酸序列；以及

(ii)一组或多组正向和反向非特异性引物，所述一组或多组正向和反向非特异性引物具有与(i)中所述非特异性核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(b)在所述容器中进行最少三轮的多引物扩增反应，其中，所述非特异性引物的组直到第三轮所述扩增反应才参与所述扩增反应；以及

(c)检测对应于所述靶DNA序列的扩增产物的存在，其中，所述扩增产物的比率反映所述样品中所述靶DNA序列的比率。

2.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述一组或多组正向和反向特异性引物还包括在所述非特异性核苷酸序列和所述特异性核苷酸序列之间的接头序列。

3.根据权利要求2所述的测定法，其中，所述接头序列具有约5至约25个核苷酸的长度。

4.根据权利要求3所述的测定法，其中，所述接头序列包括唯一的DNA条形码序列以鉴定所述样品。

5.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述靶序列包括选自由以下组成的组的基因的序列：16S rRNA、23S rRNA、18S rRNA、ITS1、ITS2、HSP65、rpoB、recA、内部转录间隔区(ITS)、人HLA、微生物毒素产生基因、微生物致病性基因、微生物质粒基因、人免疫系统基因、免疫系统组件、核糖体RNA基因以及其他非人生物体的可变基因区。

6.根据权利要求5所述的测定法，其中，所述16S rRNA靶序列包括选自由以下组成的组的区：V1V3、V3V4、V4-V5和V1V9。

7.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述靶序列包括区V1V9-EXT，所述区V1V9-EXT由以下组成：16S rRNA基因的V1V9区的部分或全部以及相邻的(i)内部转录间隔基区基因和(ii)23S基因的部分或全部。

8.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述正向特异性引物具有以下核苷酸序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATATGCGCACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGRGTTYGATYCTGGCTYAG，其中，Y是C或T，并且R是A或G。

9.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述反向特异性引物具有以下核苷酸序列CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTYACCGCRRCTGCTGGCAC，其中，Y是C或T，并且R是A或G。

10.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述正向非特异性引物具有以下核苷酸序列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACATATGCGCACACTCTTTCCCTACACGA。

11.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述反向非特异性引物具有以下核苷酸序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTC。

12.根据权利要求1所述的测定法，其中，所述样品中的所述靶DNA源自选自由以下组成的组的来源：排泄物、细胞裂解物、组织、血液、肿瘤、舌头、牙齿、颊粘膜拭子、痰、粘液、伤口拭子、皮肤拭子、阴道拭子或最初从人、动物、植物或环境样品中获得的任何其他生物材料、组织或流体，包括原始样品、复杂样品、混合物和微生物组样品。