[发明专利]用于质谱分析的多肽的依序消化

说明书

所披露的方法涉及制备用于多属性分析的多肽。在进行第一次消化之前，将这些多肽任选地变性、还原和/或烷基化。在该第一次消化之后，由该消化产生的大小片段彼此分离。然后对这些片段中较大的片段进行第二次消化。然后对来自于这两次消化的所有片段进行色谱、电泳或光谱分析，或以这些方法的组合进行分析。这些方法对于制备用于分析的治疗性多肽，特别是那些不易裂解的多肽特别有用。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年3月13日提交的美国临时专利申请号62/642,549的权益，该临时专利申请通过援引以其全文并入本文。

技术领域

提出的主题涉及多肽分析领域。具体而言，提出的主题涉及样品的制备以检测其中包含的多肽诸如治疗性多肽。所披露的方法在多肽的制备中使用依序消化和分离。

背景技术

多属性方法(MAM)依赖于分子的酶消化物，然后对目标属性进行基于质谱的表征和定量。互补决定区(CDR)中的修饰特别令人关注，因为它们可影响分子的效力和/或安全性。本发明描述了使用多种酶的新型酶消化方法。酶消化裂解蛋白质的特定氨基酸残基。由于这些特定的可裂解残基在蛋白质中的分布不均匀，因此单一酶消化可产生大肽，大肽对于使用MAM和其他分析技术进行分析具有挑战性。为了解决这个问题，通常使用第二种酶。通常，第二种酶与第一种酶一起同时使用或单独使用。常规的多种酶消化的缺点是，它以具有太多峰的复杂消化物结束，或者需要对多种酶消化进行单独分析。本文所述的方法使用多种酶以依序方式消化蛋白质，这样消除了各种酶之间的干扰，并且最终产物是具有与单一酶消化接近的肽峰数量的单一纯净消化物。这种方法对MAM和其他分析技术(诸如LC/UV肽图分析法)友好。

发明内容

本申请涉及一种制备用于分析的多肽的方法，该方法包括：

在第一次消化中裂解该多肽，其中该裂解产生该多肽的至少两个片段；将该至少两个片段彼此分离以产生第一含大肽片段的溶液和第一含小肽片段的溶液；

a.在第二次消化中裂解该第一含大肽片段的溶液的这些大肽片段，其中该第一含大肽片段的溶液的这些大肽片段中的至少一个被裂解以产生该第一含大肽片段的溶液的这些大肽片段的至少两个片段；

b.分析c.的该消化溶液和b.的该含小肽片段的溶液。

在一个实施例中，在分析之前将c.的消化溶液和b.的含小肽片段的溶液合并。

另一方面，本发明涉及一种制备用于分析的多肽的方法，该方法包括：

在第一次消化中裂解该多肽，其中该裂解产生该多肽的至少两个片段；将该至少两个片段彼此分离以产生第一含大肽片段的溶液和第一含小肽片段的溶液；

a.在第二次消化中裂解该第一含大肽片段的溶液的这些大肽片段，其中该第一含大肽片段的溶液的这些大肽片段中的至少一个被裂解以产生该第一含大肽片段的溶液的这些大肽片段的至少两个片段；

b.将这些大肽片段的该至少两个片段彼此分离以产生第二含大肽片段的溶液和第二含小肽片段的溶液；

c.在第三次消化中裂解该第二含大肽片段的溶液的这些大肽片段，其中该第二含大肽片段的溶液的这些大肽片段中的至少一个被裂解以产生该第二含大肽片段的溶液的这些大肽片段的至少两个片段；

d.分析c.的该消化溶液、b.的该第一含小肽片段的溶液和d.的该第二含小肽片段的溶液。

在一个实施例中，在分析之前将c.的消化溶液、b.的第一含小肽片段的溶液和d.的第二含小肽片段的溶液合并。