[发明专利]一种基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法

说明书

本发明提供了一种基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法，与现有技术相比，本发明利用ITS序列作为DNA条形码，ITS序列是核基因组中编码核糖体RNA(nr DNA)的基因序列，其包含较多的变异位点为多种物种鉴定提供依据。本发明还提供了能够用于霍山石斛和河南石斛品种鉴定的引物，具有扩增片段清晰、分辨力高、灵敏度好、结果可靠准确、高效快速等优点，能够将霍山石斛及其近缘种河南石斛进行鉴定，实现了高效，低成本，操作方便的霍山石斛种质资源的鉴定，保证了霍山石斛产业中霍山石斛种源的质量。

技术领域

本发明属于物种鉴定领域，具体涉及一种基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法。

背景技术

霍山石斛(Dendrobium huoshanense CZ.Tang et S.J.Chen)属兰科石斛属多年生草本植物，又名霍斛，米斛。霍山石斛是常用名贵中药材，主要分布于我国霍山大别山及邻近地区，具有极高的观赏和药用价值，自古以来被认为是药用石斛中的珍品，享有“中华仙草之最”的美誉。

现代药理研究表明：霍山石斛具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等功效，在治疗白内障和降糖保肝方面有很好的作用，但由于其对生活环境的要求极为苛刻，且自身生长缓慢，加之遭到过度采挖，霍山石斛野生资源濒临灭绝。

在霍山石斛的道地产区，采用组培快繁技术快速获得试管苗或人工诱导种子萌发产生实生苗大规模野外栽培的组培霍山石斛，已逐渐替代野生资源成为药用霍山石斛的主要来源。目前，石斛类药材市场主要以深加工的枫斗或饮片形式进行流通。

然而枫斗类石斛的基源复杂种类繁多。河南石斛(Dendrobium henanenseJ.L.Liu et L.X.Gao)与霍山石斛地理分布基本一致，且河南石斛与霍山石斛在外形上极为相似，因此河南石斛成为当前市场上霍山石斛伪品的主要来源。

现有的鉴定方法以花瓣中唇瓣是否具有一紫色斑块作为区分霍山石斛和河南石斛的主要依据，但是对于不在花期的植株或以茎入药的霍山石斛药材，很难将其与河南石斛区分开来。到目前为止，尚没有一套完善的鉴定体系用于霍山石斛和河南石斛真伪的鉴定,因此亟需建立霍山石斛的真伪鉴别方法，保证霍山石斛产业中霍山石斛的种源质量。

DNA分子标记技术具有遗传稳定、不受环境影响和检测迅速准确的优点，可以快速准确地鉴定一些外形很难区分的植物种群。近年来DNA条形码技术在物种鉴定方面使用较为广泛，DNA条形码(DNA barcoding))是利用基因中一段相对较短、标准的、公认的DNA片段对物种快速鉴定的分子技术，DNA条形码使标本鉴定过程实现自动化和标准化，其鉴定成功率很高，基本可以实现对任何能够获得合格DNA样品的鉴定，例如有形态的原植物叶片、花、种子、标本和无形态的粉末等。

随着二代测序技术的发展，DNA条形码结合二代测序技术可以实现了对中成药成分的鉴定。国际生物条形码联盟提出叶绿体基因mat K+rbc L作为植物的通用DNA条形码。

但是，由于霍山石斛及其近缘种河南石斛，利用现有的技术无法将霍山石斛与河南石斛进行区分。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法，所述DNA条形码为ITS序列，本发明方法尤其适用于鉴定霍山石斛及其近缘种河南石斛。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供的一种基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法，DNA条形码为ITS序列，用来鉴定霍山石斛。

进一步的，鉴定霍山石斛和河南石斛。

所述基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法包括以下步骤：

1)样品的DNA提取；

2)PCR扩增；

3)对PCR扩增产物进行测序；