[发明专利]一种产L-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用

说明书

本发明一种L‑半胱氨酸的基因工程菌及构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备L‑半胱氨酸中的应用。本发明通过(1)强化大肠杆菌L‑半胱氨酸合成途径的丝氨酸模块，增强大肠杆菌对丝氨酸的利用能力，(2)减弱丝氨酸的转运，减弱副产物对L‑半胱氨酸合成的影响，(3)增加硫模块合成基因的表达(4)质粒上异源表达Corynebacterium glutamicum的serC基因，得到L‑半胱氨酸高产的大肠杆菌基因工程菌株，L‑半胱氨酸产量从2.7g/L提高到3.83g/L。

(一)技术领域

本发明涉及一种产L-半胱氨酸的基因工程菌及构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。

(二)背景技术

L-半胱氨酸作为一种重要的含硫氨基酸，在生物体内起着重要的生理作用；既是某些氨基酸合成的前体物质；由于半胱氨酸含有特殊的化学键巯基，又在蛋白质的折叠、组装、稳定性等起着重要的作用。L-半胱氨酸的用途主要集中在4个行业：食品行业——用于面包的改良剂；化妆品行业——用于美容水、烫发液、防日晒的护肤膏霜；医药行业——用做化痰药，治疗支气管炎；饲料行业——用做饲料添加剂。据统计每年需要的L-半胱氨酸大约为5000吨，这个需求并不断地上涨。

目前国内L-半胱氨酸的生产主要有以下3种方法：化学合成法——以α-溴丙烯酸甲酯和硫脲为原料，反应得到2-甲基噻唑啉-4-羧酸甲酯，在进一步水解得到；毛发水解法——将毛发或者羽毛加工形成胱氨酸后，溶解在盐酸中，然后通过电解还原制得；酶催化法——第一步与化学合成法相同通过反应得到2-甲基噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)，在嗜噻唑假单胞菌的三种酶作用下不对称水解成L-半胱氨酸；综合考虑L-半胱氨酸现有生产方法的回收率和环境因素，以可再生的廉价基质用微生物发酵生产L-半胱氨酸受到越来越多的关注。而在德国Wacker公司实现了微生物发酵法产业化生产L-半胱氨酸。

随着对微生物代谢过程的不断了解，以及代谢工程技术的日益发展，使用葡萄糖等为原料来生产包括L-半胱氨酸在内的多种有机物具备广阔的生产前景。但是，由于野生型菌株自身原因，胞内合成L-半胱氨酸途径受限，所以发酵法生产L-半胱氨酸最重要的是得到适当的L-半胱氨酸高产菌株。产L-半胱氨酸的菌株获得可以通过传统诱变筛选和代谢工程技术。在代谢工程改造过程中，由于不同的代谢途径之间存在非线性的关联，以及辅因子的与主代谢途径的竞争和协作关系，往往要从多角度来进行代谢工程改造。

在大肠杆菌中L-半胱氨酸的从头合成比较复杂，在半胱氨酸合成酶cysM或cysK的催化下进行:一分子O-乙酰丝氨酸和一分子S^2-或S₂O₃^2-形成半胱氨酸。其中O-乙酰丝氨酸来源于葡萄糖，葡萄糖通过糖酵解途径生成3-磷酸甘油酸，3-磷酸甘油酸在磷酸甘油酸脱氢酶(serA)催化下生成3-磷酸丙酮酸，3-磷酸丙酮酸在磷酸丝氨酸氨基转移酶(serC)进一步催化下生成3-磷酸丝氨酸，3-磷酸丝氨酸在磷酸丝氨酸磷酸化酶(serB)进一步催化下生成丝氨酸，最后丝氨酸与乙酰-CoA在丝氨酸乙酰转移酶(cysE)的催化下生成O-乙酰丝氨酸。而S^2-则通过大肠杆菌体内由SO₄^2-还原而成，S₂O₃^2-则由胞外的S₂O₃^2-转运到胞内。L-半胱氨酸的生物合成还与NADPH有关，同时L-半胱氨酸、甘氨酸同属于丝氨酸族氨基酸，它们有着共同的前体物质丝氨酸，所以削弱竞争支路也是一种良好的策略。更重要的是L-半胱氨酸对细胞的生长具有一定的毒害作用。因此，过去对L-半胱氨酸的发酵生产尚未有深入细致的研究。

(三)发明内容

本发明的目的在于代谢工程和基因编辑技术，提供一株产L-半胱氨酸的基因工程菌，以及该基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用

本发明采用的技术方案是：

一种产L-半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建获得：