[发明专利]一种用于检测BRAF基因K601E突变的引物、探针及试剂盒

说明书

本发明涉及分子生物技术领域，公开了一种用于检测BRAF基因K601E突变的引物、探针及试剂盒。本发明独特之处在于通过在BRAF基因K601E突变检测引物的3’末端连续设计了2个错配碱基，大大提高了该突变位点检测的特异性，减少了周围临近突变位点对检测的干扰，获得了很好的检测效果。本发明还公开了一种利用上述引物和探针检测BRAF基因K601E突变的检测试剂盒，能够快速、灵敏、准确地检测BRAF基因K601E突变。本发明具有特异性好、灵敏度高、操作简便、成本低廉、结果准确、判读方便等优点，具有良好的临床应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，具体地涉及一种用于检测BRAF基因K601E突变的引物、探针及试剂盒。

背景技术

BRAF基因突变常见于一些恶性肿瘤，例如黑色素瘤、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤和大肠癌等。在甲状腺癌中，BRAF基因突变的频率也很高，其中尤以BRAF基因V600E的突变频率最高，因为该突变常常与临床不良预后相关，因此BRAF基因V600E突变是临床检测的重要靶点。

但是，BRAF基因上除了发生V600E突变外，还会发生K601E突变，V600E突变主要和甲状腺乳头状癌（PTC）相关，但K601E突变则是甲状腺滤泡型腺瘤或滤泡型甲状腺乳头状癌（FVPTC）中的特有突变。临床数据证实，和BRAF基因V600E突变不同的是，BRAF基因K601E突变往往是患者预后较好的指标之一。因此，作为一个临床良性预后的分子诊断标识，需要将K601E突变位点与BRAF基因上的其他突变位点，尤其是V600E突变位点区分开来，但目前临床上针对BRAF基因突变的检测，主要还是集中在BRAF基因V600E突变，对于BRAF基因K601E突变的检测方法和检测产品则并不多见。

本发明主要基于扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）的原理对检测体系进行设计和优化。通过检索NCBI数据库，发现BRAF基因K601E突变位点前后25bp的序列中包含5处连续的相同碱基排列，分别为AAAAA、TTT、AAA、GGG、CCC，突变位点处的序列为AAAT。根据PrimerPremier 5.0等设计软件的基本规则，在进行引物探针设计时，要避免同一碱基的重复过多，特别是避免出现连续4个或更多相同碱基，而且在引物的3’端避免为A，避免出现3个及以上连续相同的碱基。同时，在BRAF基因K601E位点附近由于还存在较多其他类型的突变，例如V600E、V600K、V600R等，这些临近位点的突变对BRAF基因K601E突变的检出也造成了很大的干扰。由于存在以上引物探针设计条件的限制，且实验中针对该区域设计的多轮引物探针测试结果显示，根据常规原理设计的引物探针组合特异性差，非特异性扩增明显，无法有效区分BRAF基因野生型和K601E突变型。该位点的引物探针设计需要寻找新的技术方案来解决现有的技术问题。

为此，本发明将引物3’末端设定为K601E突变位点的互补碱基，随后连续引入了2个错配碱基，由于PCR过程中引物延伸是由3’端开始的，3’端的碱基对引物延伸至关重要，在加入2个错配碱基之后，只有突变型模板可以依靠3’末端的碱基对互补实现稳定的扩增，而野生型模板由于3’端连续3个碱基完全不配对，无法进行有效扩增，从而有效区分了BRAF基因野生型和K601E突变型，同时该方法也可降低检测结果中假阳性的发生率。但具体引入哪两个错配碱基，才能达到最优的检测效果，需要经过对检测反应体系和反应条件的不断优化和调整，最终获得了本发明所述的最优的组合方案和PCR反应条件，使BRAF基因K601E突变能被稳定检出，且检出的突变频率的下限稳定在0.5%，优于普通ARMS-PCR的检测方法，满足了临床检测的需求。

在探针选择方面，本发明采用了特异性好、灵敏度高的Taqman MGB探针，探针3’端有NFQ-MGB非荧光淬灭基团修饰，该基团本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度,同时该修饰可以将探针的Tm值提高10℃左右，增加了探针的特异性。同时该条探针为突变体系检测和质控体系检测的通用探针，在保证检测特异性和灵敏度的基础上，降低了检测成本。