[发明专利]一种校准实时荧光定量PCR仪的方法

权利要求书

1.一种校准实时荧光定量PCR仪的方法，其特征在于包括如下步骤：

配制未知样品，进行实时荧光定量PCR反应，测定其拷贝数浓度，计算样本示值误差；

将鸭源性IL-2基因DNA标准物质进行系列稀释，进行标准曲线验证，计算线性回归系数r；

其中所述鸭源性IL-2基因DNA标准物质含有鸭源性基因组DNA。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于其中所述鸭源性IL-2基因DNA标准物质为多个浓度梯度稀释的形式。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于基因拷贝数为5.78×10³拷贝/μl，扩展不确定度为0.51×10³拷贝/μl，-20±2℃可稳定保存6个月以上，冻融10次仍可保持稳定，且产品均匀度良好，符合标准物质的要求。

4.权利要求1或2或3的方法，其特征在于其中所述鸭源性IL-2基因DNA标准物质的制备方法，包括如下步骤：鸭肉前处理；基因组DNA提取、质量鉴定；分装保存；均匀性评估、稳定性评估、定值及不确定度评估，从而得到所述标准物质。

5.根据权利要求4的方法，其特征在于其中鸭肉前处理是对鸭腿肉进行匀浆，得到的匀浆液用于提取基因组DNA；采用动物组织大提试剂盒进行基因组DNA提取。

6.根据权利要求5的方法，其特征在于其中动物组织大提试剂盒采用杭州新景生物试剂开发有限公司的动物组织大提试剂盒，具体步骤如下：

将250mg匀浆液转入50mL离心管中，加入200μL蛋白酶K溶液，再加入1.8mL 56℃预热的Buffer AT，旋涡振荡数秒使组织匀浆分散开来；

将离心管转入56℃水浴，温育30min，温育过程中旋涡振荡数次帮助组织溶解；

加入2mL Buffer SL，旋涡振荡15秒；将离心管置于70℃水浴15min；

加入2mL无水乙醇，温和翻转4-6次，混合均匀；

将混合液倒入到核酸纯化柱中，盖上盖子，≥4500rpm离心5min；

弃50mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50mL离心管中，在核酸纯化柱中加入5mLBuffer WB，盖上盖子，≥4500rpm离心2min；

弃50mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到50mL离心管中，最高速离心5min；

弃50mL离心管中的滤液，将核酸纯化柱置于另外一个洁净的50mL离心管中，放入56℃恒温培养箱中静置10min；

在核酸纯化柱中央加1-2mL 56℃温育的Buffer TE，盖上盖子，56℃温育恒温培养箱中静置5min，≥4500rpm离心2min；

弃纯化柱，洗脱DNA。

7.根据权利要求1-6任一项的方法，其特征在于其中所述荧光定量PCR中使用的引物和探针选自针对IL-2基因、COX3基因、16SrRNA基因或Cytb基因的引物和探针，优选表2-1的九种引物和探针组合之一。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于其中所述荧光定量PCR中使用的引物和探针为检测鸭IL-2基因的引物和/或探针。