[发明专利]一种平衡玻璃化冷冻试剂及其应用

说明书

本发明涉及生殖冷冻领域，特别涉及一种平衡玻璃化冷冻试剂及其应用。平衡玻璃化冷冻试剂按体积百分比计：乙二醇(EG)8‑15％、二甲基亚砜(DMSO)8‑15％、聚蔗糖‑蔗糖‑磷酸盐缓冲液(FS)70‑84％。由于本发明采用了低浓度的渗透性保护剂配方，减少了对胚胎的毒性作用，同时减少了试剂的粘性，使操作更容易，胚胎在本发明的平衡玻璃化冷冻试剂中处于平衡玻璃化状态，胚胎可以在干冰(‑78℃)的条件下存放或运输而不发生细胞内冰晶形成损伤细胞。

技术领域

本发明涉及生殖冷冻领域，特别涉及一种平衡玻璃化冷冻试剂及其应用。

背景技术

近年来我国的不孕不育率上涨幅度加快，随着环境污染、生育年龄推迟、生活压力等原因，不孕夫妇人数还在增加。随着辅助生殖技术的开展，胚胎冷冻技术在每个生殖中心得到广泛的应用，由于女方经历了控制性超促排卵，有可能得到多个卵子以及多枚胚胎。大多数患者选择将本次周期不需要的胚胎进行冷冻保存，一旦该周期未妊娠或者后期想要二胎，解冻胚胎进行自然周期的胚胎移植技术可以得到同样高的妊娠机会。

胚胎冻存是辅助生殖技术的重要组成部分,一方面对于减少多胎妊娠,避免浪费胚胎资源具有重要意义；另一方面,胚胎冻存技术对高效率、低成本保存动物种系、人类遗传疾病资源的动物模型、建立胚胎银行等都具有重要意义。因此，胚胎冷冻技术在每个生殖中心胚胎实验室中作为一项重要的技术，其保护剂的选择、冷冻及解冻方法的操作、冻融胚胎的发育潜能及着床率，均成为专家学者的讨论焦点，其重要性备受关注。

冷冻复苏技术迅速发展，尤其是操作简单、耗时短的玻璃化冷冻技术的应用使冷冻胚胎的存活率明显提高。尽管冷冻复苏技术日趋成熟，但冷冻或复苏操作过程仍有可能会对部分胚胎造成损伤。因此，对胚胎冷冻技术进行优化及质量控制十分必要。

目前冷冻胚胎的方法主要有平衡慢速冷冻技术、不平衡玻璃化冷冻技术以及平衡玻璃化冷冻技术。

平衡慢速冷冻技术是在10年前普遍应用的方法，其需要程序化冷冻仪在冷冻过程中需要技术员进行“植冰”的操作，整个过程持续3小时，漫长又费人力，这个方法目前已经被不平衡玻璃化冷冻技术替代。

不平衡玻璃化冷冻技术是通过高浓度冷冻试剂渗透胚胎，然后快速投入液氮(-196℃)中形成无结构的玻璃样物质，从而避免细胞内外冰晶的形成，保护胚胎免受机械性损伤。因此目前绝大多数生殖中心采用不平衡玻璃化技术冷冻胚胎。但是其缺点是(1)只能存放于液氮中，温度高于-130℃就会发生去玻璃化，从而产生对胚胎致命的细胞内冰晶。这就给运输冷冻胚胎带来了不方便，液氮无法上飞机，也不能密封，运输过程需要大量的液氮补给。(2)玻璃化冷冻法为达到玻璃化状态，必须用极少的液体承载胚胎，使胚胎降温速度达到10000℃/min，所以都采用开放式载杆或尼龙圈让装胚胎的液滴直接接触液氮达到高速降温，而液氮是由公司制作配送，其生物安全有待考量。有报道关于液氮交叉污染带来了潜在生物伤害问题，这方面问题仍未得到彻底解决。(3)为了确保达到玻璃化状态，玻璃化冷冻试剂大多使用30％(v/v)或者更高的渗透性保护剂，这样可以在短时间使细胞内渗入更多的冷冻试剂，残留更少的水分子。从而使胚胎在冷冻过程中承受了更大的渗透压和渗透性冷冻试剂的化学毒性及对胚胎表观遗传产生影响，敏感的卵子用玻璃化方法的发育率就很低，可以看出玻璃化冷冻剂对细胞代谢是有影响的。

随着植入前胚胎遗传学诊断技术(PGT)日益成熟，其应用越来越广泛，截止2018年12月经批准开展人类辅助生殖技术的医疗机构有498家，而开展PGT的医疗机构只有53家。所以很多生殖中心没有胚胎活检技术，患者如果要做胚胎活检，必须从能够有胚胎活检和PGT的生殖中心就诊，这无疑增加了患者的精神及经济负担和大中心的业务负担。如果患者能够就近在生殖中心冷冻胚胎，再使用方便携带运输的方式运输到有PGT资质的中心胚胎解冻及活检，将更方便患者及医疗资源的平均分配。但是现阶段大多数生殖中心使用不平衡玻璃化冷冻技术冷冻胚胎，其特点是冷冻胚胎不能离开液氮，因而也无法携带运输。