[发明专利]一种快速显示细胞膜电位正常状态与近零状态的荧光探针及其应用

说明书

本发明公开了一种快速显示细胞膜电位正常状态与近零状态的荧光探针，是4‑[2‑(9‑十二烷基‑9H‑咔唑‑3)乙烯基]‑1‑(2‑羟基乙基)‑喹啉碘盐的化合物，简称CQ12。本发明还公开了所述荧光探针在检测细胞膜电位正常状态与近零状态中的应用；在细胞膜电位为正常状态时，所述探针使细胞膜和细胞质均被染色；在细胞膜电位为近零状态时，所述探针仅使细胞膜被染色。且该探针对细胞膜电位的测量不受线粒体膜电位干扰，表现出较高的专一性。本发明探针这种直观快速的区分方式相较于目前使用的细胞膜电位探针产品，使用过程中无需校准，无需绘制标准曲线，省时省力，在生物研究和医疗诊断方面具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种测量细胞膜电位的荧光探针及其应用，尤其涉及一种利用荧光染色图像变化快速显示细胞膜电位正常状态与近零状态的荧光探针及其应用。

背景技术

细胞膜电位是细胞静息状态时细胞膜内外两侧存在的电位差，是反映细胞活性与细胞代谢活动的重要指标，多数细胞的正常膜电位都表现为内负外正，位于-50～-100mV范围内。然而，在某些类型细胞内，细胞膜电位会显著减小。例如，U.V.Lassen在1967年发现人类红细胞的细胞膜电位小于-14mV；S.Hodson在1989年报道了兔子的角膜内皮细胞的细胞膜电位在0mV左右，因而提出了“近零膜电位”的概念。除了本身具有近零膜电位的细胞外，某些细胞的膜电位在不同生理、病理状态时进入近零状态。例如，MCF-7细胞的膜电位会在细胞周期的G0 and G1相降至-9mV；淋巴细胞在促有丝分裂的刺激下细胞膜电位会降至接近零；细胞死亡后细胞膜电位不能维持，也为近零状态。在基础医学领域中，越来越多的研究表明细胞膜电位的近零状态对细胞的生理活动有着重要的影响。例如，HEK-293细胞上的离子通道TRPM4b调控的电流会在近零状态下发生反转。HeLa细胞上的β-半乳糖苷酶的跨膜运输在近零状态下几乎被完全抑制。因此，能够测量或区别细胞膜正常和近零电位的技术方法在生物和医学研究中均具有重要应用价值。

测量细胞膜电位最常用的是膜片钳技术，但它需要运用微玻管电极接触细胞膜，有较高的侵入性，且只针对单个细胞，无法同时对大量细胞进行测量。另一种方法是根据细胞膜电位变化而发生荧光颜色或荧光强度变化的荧光探针法，由于此类探针是小分子化合物，对细胞活动影响小，可同时观察大量细胞群体的膜电位变化，很好地解决了膜片钳技术存在的不足。

目前报道的膜电位荧光探针根据响应时间快慢可分为快响应型与慢响应型两种。

(1)快响应型膜电位探针也叫电致变色染料，它们在外加电场下发射峰会发生移动，由于移动很小(10nm左右)，故通常收集光谱边缘的光作为信号。因此，这类探针的荧光响应敏感性较小，通常不到10％/100mV。

(2)慢响应型探针是一些带电的脂溶性的荧光团，可快速透过细胞膜，它们又可分为阴离子型和阳离子型。阳离子型膜电位探针是最广泛使用的慢响应型探针，这类探针往往会聚集在线粒体上，而且来自线粒体的荧光信号往往会超过细胞质中的，从而干扰细胞膜电位的测量，因此在使用时需要保持线粒体膜电位稳定。阴离子型膜电位探针虽然没有上述缺点，但是此型探针有些会与细胞内蛋白结合，对细胞代谢产生影响。除此之外，虽然上述两种慢响应型探针的荧光响应敏感性较大(80％/100mV)，但都存在使用不便的问题。如慢响应型探针使用时必须要校准，且每次实验通常需要绘制自己的校准曲线，费时费力又不够快速直观。基于此，开发敏感性高、操作简便的能快速显示细胞膜电位正常状态与近零状态的荧光探针具有迫切的现实意义和重要的应用价值。

发明内容

针对目前测量细胞膜电位方法的不足，本发明要解决的问题是提供一种利用荧光染色图像变化快速显示细胞膜电位正常状态与近零状态的荧光探针及其应用。与现有的细胞膜电位测量方法相比，本发明的荧光探针具有快速、直观、简便的技术特点。

本发明所述快速显示细胞膜电位正常状态与近零状态的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针是化学名称为4-[2-(9-十二烷基-9H-咔唑-3)乙烯基]-1-(2-羟基乙基)-喹啉碘盐的化合物，简称：CQ12；其化学结构如式(I)所示：