[发明专利]检测小麦Glu-B3位点拷贝数的引物、探针及其检测方法

权利要求书

1.用于检测小麦Glu-B3位点拷贝数的引物和探针，其特征在于，

所述引物的核苷酸序列为：

上游引物glub3F：5’-CAAGTCATCTTTAGCAAGCATCAGG-3’，SEQ ID NO：1所示；

下游引物glud3R：5’-AAGGTCTTCATGGTGGACTAGTGTT-3’，SEQ ID NO：2所示；

探针glub3T的核苷酸序列为：5-ATAGTAGCCAGGGCACCACCTCTTT-3’，SEQ ID NO：3所示，探针glub3T的5’端连接有报告荧光基团FAM，3’端连接有淬灭荧光基团BHQ1。

2.利用权利要求1所述的引物和探针检测小麦Glu-B3位点拷贝数的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，制备反应体系，所述反应体系如下：

2×ddPCR Supermix for Probes 20ul，

终浓度900nM的目的上、下游引物各1.8ul，

终浓度900nM的内参上、下游引物各1.8ul，

终浓度250nM的目的探针0.5ul，

终浓度250nM的内参探针0.5ul，

终浓度330ng的DNA模板1.8ul，

所述DNA模板为小麦基因组DNA；

所述内参上游引物核苷酸序列为：5’-GCAATGTAGCTGCGCTTCAC-3’，SEQ ID NO：4所示；

内参下游引物核苷酸序列为：5’-CCTGCAACCGTGGATTAAGT-3’，SEQ ID NO：5所示；

内参探针核苷酸序列为：

5’-ACAGTAGCAGCACCAACATAACCCACAGC-3’，SEQ ID NO：6所示，5’端所连的荧光基团为5’-HEX，3’端所连的荧光基团为3’-BHQ1；

S2，利用ddPCR技术，以S1的体系进行反应；

S3，将反应完成的体系于微滴读取仪中进行拷贝数检测，得到小麦Glu-B3位点拷贝数。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S1的DNA模板经过限制性内切酶BamHI酶切处理，酶切体系：50ul的反应体系包含1ug基因组DNA，1ul BamHI限制性内切酶，5ul 10×NEBuffer，补加无菌双蒸水至50ul；

程序为：37℃酶切3h，4℃保存备用。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2中，ddPCR反应程序为：95℃酶活化10min；94℃变性30s；59℃退火/延伸1min；40次循环；98℃酶失活10min；4℃保存待用，升降温速度2.0℃/s。