[发明专利]一种植物组织半薄切片的制作方法

说明书

本发明公开了一种植物组织半薄切片的制作方法。所述植物组织半薄切片的制作方法包括如下步骤：选取植物组织依次经固定、脱水、预渗透、渗透、包埋、切片、烤片、脱树脂和染色；采用钢刀片进行所述切片；依次采用番红和固绿进行所述染色。本发明利用石蜡切片中常用的钢刀片为切片刀具，扩大了树脂切片的使用范围。本发明染色使用番红‑固绿复染的方法，与甲苯胺蓝染液相比，番红价格低于甲苯胺蓝的价格，储存要求也不高，在室温下即可保存，配置过程简便易行，不易产生沉淀，不同的组织结构呈现不同的颜色，可以更加明显的体现出组织的不同结构和成分，提高了切片的质量和图像效果。

技术领域

本发明涉及一种植物组织半薄切片的制作方法，属于生物技术领域。

背景技术

树脂半薄切片是一种应用非常广泛的形态学研究技术，常用于透射电镜样品制备中的超薄切片组织定位。与石蜡切片相比，树脂半薄切片的制作程序和步骤有所简化，周期较短，且切片的厚度更薄，一般厚度仅为2～7μm，因此，半薄切片图像的清晰度及分辨率优于石蜡切片，且视野大于超薄切片，有利于获得高质量的光镜图像。从取材到染色涉及到多个步骤，任何环节出现问题都会影响到样片制备质量甚至导致样品制备失败。一种好的染色方法即可将树脂半薄切片技术的优势和特点更加完美的体现出来。甲苯胺蓝是常用的一种人工合成染料，植物半薄切片制备过程中常用的染色剂属于醌亚胺染料类，其中的阳离子有染色作用，组织细胞的酸性物质与其中的阳离子结合而被染色，故其染色为单一染色，缺乏层次，没有对比度，同时甲苯胺蓝染色剂溶液易沉淀变性，以上这些会影响半薄切片的质量和图像效果。因此，针对现有技术中甲苯胺蓝染色和玻璃刀价格昂贵等缺点，需要提供一种新的植物组织半薄切片的制作方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物组织半薄切片的制作方法，本发明方法采用常用钢刀切取半薄切片，并采用番红-固绿复染，能够以满足不同的组织切片和染色要求，获得高质量的半薄切片和图像效果。

本发明所提供的植物组织半薄切片的制作方法，包括如下步骤：

选取植物组织依次经固定、脱水、预渗透、渗透、包埋、切片、烤片、脱树脂和染色；

采用钢刀片进行所述切片；

依次采用番红和固绿进行所述染色。

上述的制作方法中，所述固定步骤可采用常规方法，如在2.5％戊二醛固定液中24h以上，抽真空，使组织和细胞充分固定；然后采用0.1M PBS缓冲液漂洗固定后的组织(如叶片)3遍，每次20min；再用蒸馏水漂洗2遍，每次20min，充分洗去固定液。

上述的制作方法中，所述脱水的步骤如下：采用50～100％的乙醇水溶液进行逐级脱水，且采用50～95％的乙醇水溶液进行脱水一次，每个梯度放置1h；采用100％乙醇水溶液进行脱水两次，每次放置1h；

如依次采用50％、70％、80％、90％、95％和100％的乙醇水溶液逐级脱水，具体可采用50％的乙醇水溶液脱水1h，70％的乙醇水溶液脱水1h，80％的乙醇水溶液脱水1h，90％的乙醇水溶液脱水1h，95％的乙醇水溶液脱水1h，100％的乙醇水溶液脱水两次，每次1h，为防止在纯乙醇中过度脱水，因此在纯乙醇中不得放置超过2h。

上述的制作方法中，所述预渗透采用的预渗透液由体积比为1：1的Technovit和乙醇组成；

所述渗透液由Technovit和HardenderⅠ组成，两者的配比为100mLTechnovit：1gHardenderⅠ；

所述预渗透的时间为2.5～4h，所述渗透的时间为20～24h。