[发明专利]一种利用微生物转化生产7α-羟基-脱氢表雄酮的方法

说明书

本发明属于微生物甾体转化技术领域，公开了一种7α‑OH‑DHEA的生物合成方法。涉及生产菌株为蓝色犁头霉(Absidia coerulea)，具体为蓝色犁头霉CGMCC 14124，生产原料为脱氢表雄酮(DHEA)。利用该菌种的选择性羟基化能力对DHEA进行生物转化，可以有效合成目标产物7α‑OH‑DHEA。底物DHEA的投料浓度高达5.5g/L时，目标产物的生成率达到了45.5％。该方法实现了绿色环保的生产，为该甾体药物的工业化生产提供了基础。

技术领域：

本发明涉及微生物甾体转化和工业真菌技术领域，具体涉及利用一株蓝色犁头霉通过转化DHEA生成7α-OH-DHEA，得到一种制备7α-OH-DHEA。

背景技术：

甾体类药物具有重要的生理活性，是仅次于抗生素的第二大类药物。脱氢表雄酮(DHEA)是自然界生物体内重要的活性物质，对生命代谢活动具有重要调节作用，其羟基化产物7α-OH-DHEA医学上用于控制体重，治疗阿尔茨海默症，具有广泛应用，且高效、低毒。是一种重要的甾体药物，市场需求量极大，应用价值极大。

目前工业上利用化学合成7α-OH-DHEA以醋酸脱氢表雄酮为原料，主要有两种：通过溴代、异构化、酯化、水解得到目标产物，工艺繁琐；通过过氧苯甲酰叔丁酯的自由基取代在7α位一步引入酰氧基，再经水解得到产物。二种方法在合成过程中涉及多种有机试剂，成本非常高，比如醋酸银价格昂贵，同时大量有机溶剂的使用造成环境污染，而且反应条件较为苛刻，反应收率也有限。解决这些问题是甾体工业大规模工业化的关键。

自20世纪50年代利用微生物首次合成甾体激素进入商业化以来，微生物转化已经广泛应用于许多载体药物或药物中间体合成。微生物转化较化学合成药物具有诸多优势：微生物能够产生许多化学结构独特的物质，化学合成途径难以获得；微生物生长周期短，易于调控能够大规模发酵实现工业化生产。现有报道转化DHEA7α羟基化的菌株主要有亚麻刺盘孢、总状毛霉和赤霉菌等，但存在投料浓度低、副产物多等问题，无法满足工业生产要求。蓝色犁头霉是目前甾体药物工业化生产中常见的菌株，且经ARTP诱变与ARTP-LiCl复合诱变选育获得的蓝色犁头霉AL-172具有生长速度快、繁殖周期短、催化效率高的特点。本专利采用高转化率的蓝色犁头霉菌株进行7α-OH-DHEA的生产，为该类甾体药物的合成提供了新途径，具有重要市场经济价值。

发明内容：

为了实现上述目的，本发明将提供一种高效生物转化生产7α-OH-DHEA工艺。具体为通过一株性能优异的蓝色犁头霉菌株，在高投料浓度条件下的进行DHEA7α羟基化的生物转化工艺。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株性状优异的蓝色犁头霉菌株AL-172(Absidia coerulea)，其微生物保藏号CGMCC 14124；保藏时间2017年5月11日；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心。应用上述菌株转化DHEA生成7α-OH-DHEA的方法，其步骤如下：

将蓝色犁头霉AL-172种子液以10％-15％接种量转接入发酵培养基，25-30℃，170-200r/min发酵培养5-8h后，先使用0.3-1.0g/L的DHEA进行诱导，待培养pH至3.8-4.2时，调节发酵液pH至5.6-6.0，同时向发酵培养基中投入浓度2-5g/L的DHEA，转化5-7h后，再次调节发酵液pH至5.4-6.0，补齐剩余底物使得总投料浓度达到3-8g/L，总转化周期48h，期间定时对取样。发酵液经有机溶剂萃取后，取上清液，高效液相色谱检测转化情况。

本发明所述的种子培养基成分如下(g/L)：玉米浆12，葡萄糖10.5，硫酸铵5，酵母膏2-3；水配制，pH6.5。发酵培养基成分如下(g/L)：玉米浆12，葡萄糖11，硫酸铵5，酵母膏2-3；去离子水配制，pH6.5。

所述种子液的培养条件如下：1ml孢子悬浮液接种于种子培养基，在26-30℃，转速170-220r/min的条件下进行培养至培养液pH达到3.8-4.4。