[发明专利]一种谷氨酸脱氢酶突变体、编码基因及制备L-草铵膦的方法

权利要求书

1.一种谷氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的野生型谷氨酸脱氢酶突变所得，突变方式为以下一种：

（1）A145G、I174S、V352A或I408F；

（2）A145G/A380I、A145G/A380Y、A145G/A380S或A145G/A380C；I174S/A380I、I174S/A380Y、I174S/A380S或I174S/A380C；V352A/A380I、V352A/A380Y、V352A/A380S或V352A/A380C；I408F/A380I、I408F/A380Y、I408F/A380S或I408F/A380C；

（3）A145G/T99V/I101Y、A145G/T99I/I101Y或A145G/T99V/I101F；I174S/T99V/I101Y、I174S/T99I/I101Y或I174S/T99V/I101F；V352A/T99V/I101Y、V352A/T99I/I101Y或V352A/T99V/I101F；I408F/T99V/I101Y、I408F/T99I/I101Y或I408F/T99V/I101F；

（4）A145G/T353I/F357Y、A145G/T353S/F357Y或A145G/T353Y/F357C；I174S/T353I/F357Y、I174S/T353S/F357Y或I174S/T353Y/F357C；V352A/T353I/F357Y、V352A/T353S/F357Y或V352A/T353Y/F357C；I408F/T353I/F357Y、I408F/T353S/F357Y或I408F/T353Y/F357C；

（5）G72S/A145G/T99V/I101Y、G72C/A145G/T99V/I101Y或G72I/A145G/T99V/I101Y；G72S/I174S/T99V/I101Y、G72C/I174S/T99V/I101Y或G72I/I174S/T99V/I101Y；G72S/V352A/T99V/I101Y、G72C/V352A/T99V/I101Y或G72I/V352A/T99V/I101Y；G72S/I408F/T99V/I101Y、G72C/I408F/T99V/I101Y或G72I/I408F/T99V/I101Y。

2.如权利要求1所述谷氨酸脱氢酶突变体的编码基因。

3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，野生型谷氨酸脱氢酶基因的NCBI登录号：YP_001086649.1，谷氨酸脱氢酶突变体的突变方式为A145G/T99V/I101Y、I174S/T99V/I101Y、V352A/T99V/I101Y或I408F/T99V/I101Y时，编码谷氨酸脱氢酶突变体的基因中编码G72氨基酸的密码子由GGT突变为GGG。

4.如权利要求1所述谷氨酸脱氢酶突变体、如权利要求2所述编码基因、或如权利要求3所述编码基因在制备L-草铵膦中的应用。

5.包含如权利要求2或3所述编码基因的表达载体。

6.包含如权利要求5所述表达载体的基因工程菌。

7.如权利要求6所述基因工程菌在制备L-草铵膦中的应用。

8.一种制备L-草铵膦的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）发酵培养如权利要求6所述基因工程菌，制备酶液；

（2）将所述酶液加入含有底物2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸、铵离子及还原型辅酶的体系中，进行还原胺化反应，制得L-草铵膦。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述还原型辅酶为NADH。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）的反应体系中还包括辅酶再生系统，所述辅酶再生系统为以下任一种：

以葡萄糖脱氢酶为辅酶再生酶、以葡萄糖为辅酶再生底物的葡萄糖脱氢酶辅酶再生系统；

以醇脱氢酶为辅酶再生酶、以异丙醇为辅酶再生底物的醇脱氢酶辅酶再生系统；

或者，以甲酸脱氢酶为辅酶再生酶、以甲酸盐为辅酶再生底物的甲酸脱氢酶辅酶再生系统。