[发明专利]基于数字PCR用于血源筛查的引物、探针及试剂盒

说明书

本发明提供了基于数字PCR用于血源筛查的引物组合、探针组合及包括了上述引物组合和探针组合的试剂盒及其检测方法。本发明所提供的试剂盒根据HBV、HCV、HIV、TP的基因序列设计扩增引物和taqman探针，特异性检测目标基因，检测位点的筛选主要标准为序列保守，无重复序列。使用本发明所提供的试剂盒，无需标准曲线，即可绝对定量，其对HBV、HCV、HIV及TP检测的灵敏度相比荧光PCR提高10倍以上，病原体检出的窗口期进一步缩短。

技术领域

本申请涉及数字PCR技术领域，尤其涉及一种基于数字PCR用于血源筛查的引物、探针及试剂盒。

背景技术

为了保障临床用血的安全和血液制品的质量、防止供受血之间的交叉感染和采血及血液制品工作者的健康，必须防止乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒等疾病的感染者进入供血队伍，防止上述疾病病原体阳性血浆直接输注病人或用于血液制品生产。

目前，在临床上筛选各种血源性传播疾病的方法，主要是免疫学诊断方法。但由于受免疫学诊断方法的灵敏度及与生俱来的限制，依然不能完全杜绝阳性病毒血样的漏检，漏检率较高。其主要原因在于：免疫学诊断主要依赖抗原抗体介导的免疫反应，而病毒感染机体后，机体产生可检测水平的高滴度抗体的需要一段相对较长的时间。另外，由于个体免疫机能不同，其中有少数感染者感染后机体所产生的抗体滴度有可能低于免疫学检测限以下，甚至不产生抗体。因此，免疫学诊断方法不能检测出处于窗口期和新近感染病毒的献血员，这样势必导致漏检。其次，抗原出现变异以及稀有亚型也可导致漏检，因此，免疫学筛查后，输血相关疾病传播依然存在一定的概率。

近5年来，随着以核酸检测(Nucleic acid test，NAT)为代表的分子生物学技术在血液筛查方面的应用，输血及血制品安全性有了很大的提高。在理论上，NAT技术能够显著缩短病原体检出的窗口期，NAT技术灵敏度和特异性均较显著的高于免疫学方法。核酸检测HBV，HCV，HIV病毒的窗口期较抗体检测分别提前：9天、25天、14天。而应用NAT技术筛查，可将献血员传播以上病毒性疾病的概率分别降低42％、72％和50％。除以上三种病毒外，梅毒的发病率近年来呈上升趋势，也是影响血液安全的一大因素。

随着NAT技术在临床检验中应用的日趋完善和成熟，现阶段在世界范围内开展大规模血液筛查多采用NAT技术。应用最多最常见的NAT技术是荧光-PCR(TaqMan技术)，但是，荧光PCR定量时需要标准品，是一种相对定量方法，结果判断依赖扩增效率，抑制剂耐受性较低。

发明内容

鉴于背景技术中存在的问题，本申请的目的在于提供一种基于数字PCR用于血源筛查的引物、探针及试剂盒。

为了达到上述目的，本申请的第一方面提供了一种基于数字PCR用于血源筛查的引物组合，包括HBV检测引物、HCV检测引物、HIV1检测引物、HIV2检测引物和内标检测引物；所述HBV检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的下游引物；所述HCV检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物；所述HIV1检测引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物；所述HIV2检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的下游引物；所述内标检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的下游引物。

优选地，本申请所提供的用于血源筛查的引物组合，还包括TP检测引物，所述TP检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的下游引物。