[发明专利]一种L-酪氨酸基因工程菌及其生产L-酪氨酸的方法和应用

权利要求书

1.一种L-酪氨酸基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌是通过代谢工程的方法对大肠杆菌中L-酪氨酸合成相关基因进行对应改造，仅包括莽草酸途径的强化，解除tyrAB关键酶的转录负调控两步分子操作。

2.根据权利要求1所述的L-酪氨酸基因工程菌，其特征在于：所述工程菌在制备时，首先，为避免添加诱导剂IPTG，敲除了大肠杆菌基因组上乳糖操纵子中的调节基因lacI，接着将受trc启动子控制的aroG(S180F)整合到yjiv假基因位点，再次，敲除了对L-酪氨酸合成基因tyrAB有阻遏作用的基因tyrR。

3.根据权利要求1或2所述的L-酪氨酸基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌以E.coliW3110为出发菌株。

4.如权利要求1至3任一项所述的L-酪氨酸基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：

⑴采用大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑技术，以E.coliW3110为出发菌株，敲除lacI基因；

⑵构建Ptrc启动子和aroG(S180F)的连接片段，并将其整合至yjiv假基因位点；

⑶敲除tyrR基因，即得L-酪氨酸基因工程菌。

5.利用如权利要求1至3任一项所述的L-酪氨酸基因工程菌生产L-酪氨酸的方法，其特征在于：步骤如下：

利用摇瓶发酵生产L-酪氨酸：

按10-15％的接种量进行发酵培养，发酵过程中以苯酚红作指示剂，通过补加氨水控制pH在7.0-7.2，发酵过程中补加葡萄糖溶液。

6.利用如权利要求1至3任一项所述的L-酪氨酸基因工程菌生产L-酪氨酸的方法，其特征在于：步骤如下：

⑴种子培养：当种子培养液OD₆₀₀达到10-15时，准备接入发酵培养基；

⑵发酵培养：按10％-15％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，培养温度为37℃，通过自动流加氨水控制培养基pH为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25％-30％，以泡敌消泡，当培养基中葡萄糖耗尽时，脉冲流加80％的葡萄糖溶液，并通过测定发酵液中的葡糖糖浓度调整脉冲比，保证发酵液中的葡萄糖浓度控制在0.2-2g/L，发酵时间控制在24-26h。

7.根据权利要求6所述的生产L-酪氨酸的方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方为：

葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，(NH₄)₂SO₄5 g/L，KH₂PO₄4 g/L，MgSO₄·7H₂O 2g/L，柠檬酸钠2g/L，FeSO₄·7H₂O 30mg/L，微量元素混合液1.5mL/L，V_B10.5 mg/L，V_H0.5 mg/L，pH 7.0-7.2，115℃高压蒸汽灭菌20min。

8.根据权利要求7所述的生产L-酪氨酸的方法，其特征在于：所述微量元素混合液包括：Na₂MoO₄·2H₂O 2.5g/L，AlCl₃·6H₂O 2.5g/L，NiSO₄·6H₂O 2.5g/L，CoCl₂·6H₂O 1.75g/L，CaCl₂·2H₂O 10g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.5g/L，CuCl₂·2H₂O 0.25g/L，H₃BO₃0.125 g/L。

9.如权利要求1至3任一项所述的L-酪氨酸基因工程菌在L-酪氨酸生产方面中的应用。