[发明专利]一种貉细小病毒VP2基因、表达载体、重组菌、制备VP2蛋白的方法和组装方法

说明书

本发明提供了一种貉细小病毒VP2基因、表达载体、重组菌、制备VP2蛋白的方法和组装方法，属于疫苗制备技术领域，所述貉细小病毒VP2基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明将貉细小病毒VP2基因和分子伴侣共同转化入ER2566细胞中，分子伴侣提高了VP2蛋白的正确折叠率。本发明提供的貉细小病毒VP2基因可形成高质量的貉细小病毒病毒样颗粒。本发明提供的貉细小病毒病毒样颗粒疫苗，经纯化后，血凝效价能达到2¹⁶，具有与天然病毒相似的血凝性。

技术领域

本发明属于疫苗制备技术领域，尤其涉及一种貉细小病毒VP2基因、表达载体、重组菌、制备VP2蛋白的方法和组装方法。

背景技术

貉细小病毒(Raccoon dogparvovirus，RDPV)能够引起貉细小病毒性肠炎，这是一种急性、高度接触性传染病，发病率和死亡率都很高，是危害貉业养殖与发展的重要传染病之一。目前貉细小病毒性肠炎广泛存在于世界各个国家。不同年龄和品种的貉均有易感性，但尤以50～60日龄的仔貉和幼貉最为易感，幼貉的发病率为70％以上，死亡率高达90％；成年貉的发病率为 30％左右，死亡率在30％以下。患病貉和耐过貉是该病的主要传染源，病毒通过粪、尿、唾液等排出体外，经消化道和呼吸道传染给易感的健康貉。该病全年都可发生，常呈地方性流行。一旦传入貉场，如果兽医防疫卫生措施不完善，会导致疾病长期存在和周期性发生，给养殖户带来巨大的经济损失。

RDPV是细小病毒科、细小病毒属的主要成员，为无囊膜单链DNA病毒，核衣壳由VP1、VP2、VP3三种结构蛋白组成，其结构与细小病毒科其他成员的核衣壳结构类似。其中具有凝血活性的VP2是构成病毒衣壳蛋白的主要成份。

RDPV最早是由犬细小病毒跨宿主感染貉而产生，是CPV的同属异种病毒，与猫泛白细胞综合征病毒、水貂肠炎病毒等肉食兽细小病毒亲源较近。 RDPV在我国首次被发现是在1984年的黑龙江省，1988年夏咸柱等从不同地区的肠炎型病貉体内成功分离出RDPV，首次证实了RDPV在我国的存在。之后，我国各地先后均有貉细小病毒性肠炎出现的报道；明显，貉细小病毒在我国的散播有愈演愈烈的趋势。

由于国内市场上还未有专用于貉的细小病毒性肠炎疫苗，一直在使用水貂细小病毒性肠炎灭活疫苗进行免疫预防，但替代疫苗存在免疫保护率低，貉的细小病毒发病率仍然很高，并且替代的灭活疫苗在生产过程中往往存在灭活不彻底或灭活剂(多数为甲醛)使用量超标的现象，给疫苗的下一步使用带来了极大的隐患。同时甲醛具有较大毒性，因此使用甲醛作为灭活剂对貉具有一定毒性，往往在接种部位造成局部炎症反应，甚至是化脓、溃疡，影响貉皮整张质量，造成经济损失。同时，灭活疫苗只能调动起机体的体液免疫，无法刺激机体细胞免疫应答的产生。因此，研制出安全、有效的貉细小病毒性肠炎的疫苗是控制貉细小病毒性肠炎的有效方法。

目前，新型病毒样颗粒亚单位疫苗获得了广泛的研究。而RDPVVP2蛋白形成的病毒样颗粒具有与RDPV病毒粒子相似的结构，且不含有病毒的遗传物质，不能自主复制，没有感染性，能以天然构象和模式递呈抗原，有效刺激体液和细胞免疫，诱导貉体产生良好的免疫反应。

目前，研究报道的用于表达病毒样颗粒的主要是昆虫细胞表达系统，但其生产成本较高。相比之下，原核表达系统蛋白表达量高，生产成本低，生产操作简单，但在实际操作中，多数蛋白由于不能正确折叠而形成包涵体，为后续的研究工作及应用带来障碍。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种貉细小病毒VP2基因、表达载体、重组菌、制备VP2蛋白的方法和组装方法，本发明将貉细小病毒VP2基因和分子伴侣共同转化入ER2566细胞中，分子伴侣提高了VP2蛋白的正确折叠率。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种貉细小病毒VP2基因，所述貉细小病毒VP2基因具有SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。