[发明专利]水稻miRNA纯合致死突变体的制备方法

说明书

本发明属于基因工程领域，具体涉及水稻miR390纯合致死突变体的制备方法。本发明要解决的技术问题是：获得无法萌发的水稻致死突变体种子。本发明技术方案是提供一种用于CRISPR‑Cas12a基因编辑方法中进行水稻OsmiR390基因定向敲除的crRNA、以及制备水稻miR390纯合致死突变体的方法。本发明方法能够有效敲除水稻OsmiR390基因，并得到具有纯合致死表型的功能性缺失突变体，这在水稻的基因组功能研究以及miRNAs的研究和应用方面具有很好的前景。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及水稻miR390纯合致死突变体的制备方法。

背景技术

MicroRNAs(miRNAs)是真核生物中一类非编码内源小分子RNA(一般为19-24nt)，它通过对靶mRNA的剪切或抑制翻译来调控基因的表达，从而对靶基因实施转录后水平调控。在植物器官形成、生长发育、信号转导及非生物胁迫应答等过程中起重要作用。MicroRNA390(miR390)家族是一个古老的高度保守的家族，其主要的靶基因AGO7是RNA沉默复合体的重要组成成分，广泛参与对靶miRNA的剪切，可能在植物的生长发育、侧生器官极性形成、花器官形成及胁迫等方面有作用。但是目前在水稻中miR390的确切功能还知之甚少，主要是缺乏该基因的突变体材料。

过去，研究miRNA功能主要通过靶基因类似物(Target Mimicry，TM)或短串联靶标类似物(Short Tandem Target Mimic，STTM)来干扰(封闭)miRNA，从而能反映目标基因去阻遏的影响。但该模式对很多miRNA的干扰效率较低，甚至完全无活性的情况。近来，也有用CRISPR-Cas9来创制miRNA突变体的报道，但现有技术创制的突变体的缺失/插入片段大多集中在1～2bp的范围内，往往不会导致miRNA功能的完全丧失。

CRISPR-Cas12a(CRISPR-Cpf1)系统是近年来发现的新的基因编辑系统。其与CRISPR-Cas9不同，因其具备“T/A”富集区的PAM识别位点、向导RNA为结构简单的单一crRNA分子、产生粘性末端、删除片断比较大(大多为6～13bp)等特性或优点，对于定向敲除miRNA有其特有的优势。目前尚无运用该技术敲除水稻miR390的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：运用CRISPR-Cas12a系统敲除水稻OsmiR390，获得无法萌发的水稻致死突变体种子。

本发明要解决技术问题的技术方案是提供一种用于CRISPR-Cas12a基因编辑方法中进行水稻OsmiR390基因定向敲除的crRNA。该crRNA的核苷酸序列为AUUUCGAGGCGCUAUCCCUCCUG(SEQ ID No.1)。

本发明同时提供了能表达上述的crRNA的表达载体。

进一步的，上述的表达载体中的crRNA表达单元的序列为SEQ ID No.2所示。在SEQID No.2所示的序列中，1-1531为水稻泛素启动子pOsUbi1；1532-1704为crRNA scaffold单元；1705-2024为终止子NOS-T

其中，上述的表达载体中还含有Cas12a蛋白的表达单元。

进一步的，上述的表达载体中的Cas12a蛋白的表达单元的核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示。在SEQ ID No.3所示的序列中，1-1996为玉米泛素启动子pZmUbi1；1997-5787为带NLS序列的Cas12a；5788-6043为终止子HSP-T。

其中，上述表达载体的骨架载体为pTX377、pYPQ230。

优选的，上述表达载体的核苷酸序列为SEQ ID No.9所示。

本发明也提供了上述的crRNA或表达载体在制备水稻miRNA纯合致死突变体中的用途。