[发明专利]一种去除卵细胞细胞核的方法

说明书

本发明公开了一种去除卵细胞细胞核的方法，利用小鼠为模型，使用链霉蛋白酶处理MII期卵细胞将透明带消化后，使用切割刀具将卵细胞切割两半，弃去含极体1/3～1/2的胞质，将含有极体的胞体用Hoechst染色剂染色，在荧光显微镜下镜检，检测去核率；利用手工去除卵细胞细胞核的方法能显著增加卵细胞去核效率，为大规模克隆动物的生产成为可能。

技术领域

本发明涉及细胞生物技术领域，特别是指一种去除卵细胞细胞核的方法。

背景技术

进入21世纪以来生命科学尤其是动物克隆技术应用于遗传育种取得巨大成就，为人类农业及生命健康做出了重大贡献。自克隆羊多利的诞生以来，动物克隆技术迅速发展。哺乳动物克隆技术包含卵细胞去核、克隆动物体细胞植入去核卵细胞、激活重构卵细胞及体外发育、植入代孕母体内发育等程序，卵母细胞去核技术是动物克隆程序中关键技术之一。

目前卵母细胞去核技术主要有化学去核法和显微操作去核法两大类。化学去核法利用化学药物阻碍卵母细胞纺锤体正常分离达到去核目的，往往化学去核效率低，药物作用不利于卵的发育问题。显微操作去核需要对操作仪器要求很高，实验室无法承担高昂的显微操作设备。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提出一种去除卵细胞细胞核的方法，提高去核的可操作性和去核效率。

基于上述目的本发明提供的一种去除卵细胞细胞核的方法，包括体外成熟卵母细胞获取、去除卵细胞透明带和切割卵母细胞除核步骤。

可选的，所述体外成熟卵母细胞获取包括如下步骤：选择健康，处于发情前期的5～8周龄雌鼠，无菌手术摘取输卵管壶腹部，用M2漂洗2～3次，夹取输卵管在显微镜用注射器针头划破输卵管壶腹部，收集卵丘-卵母细胞复合物，将复合物转移至透明质酸酶中慢慢吹打脱去颗粒细胞；收集MII期的卵母细胞并用M2洗3～4次，将获取的MII期的卵母细胞置于培养箱中。

可选的，所述去除卵细胞透明带，将所述的MII期的卵母细胞采用链霉蛋白酶处理至透明带消化后，转入FBS胎牛血清溶液中终止消化，将去除透明带的卵母细胞置于培养箱中。

可选的，所述链霉蛋白酶的浓度为0.3～1.0％。

可选的，所述FBS胎牛血清浓度为5～15％。

可选的，所述切割卵母细胞除核包括如下步骤：将透明带已消化的卵母细胞移入切割滴中，在显微镜下快速切割卵细胞，切割后弃去含极体1/3～1/2的胞质。

可选的，所述切割滴为2.0～3.0ug/mL细胞松弛素B。

可选的，所述培养箱的温度35～40℃，CO₂含量为3～8％。

从上面所述可以看出，本发明提供的一种去除卵细胞细胞核的方法，利用手工去除卵细胞核既不需要高昂的显微设备又不需要药物作用，仅在普通工具在显微镜下便可完成去核。手工去除卵母细胞细胞核不仅不需要昂贵的显微操作仪器而且去核操作简单且去核效率高的优点。

手工去除卵母细胞细胞核的方法，在短时间内获得大量的去核卵细胞。该方法能够为克隆动物提供充足材料来源，去核低毒对卵细胞伤害小，操作简单特点，成为推广的应用的先决条件。

附图说明

图1为本发明实施例工艺流程图；

图2为本发明实施例霉蛋白酶处理MII期的卵母细胞示意图；

图3为本发明实施例卵细胞全部消除透明带示意图。

具体实施方式

为下面通过对实施例的描述，本发明的具体实施方式如所涉及的制造工艺及操作使用方法等，作进一步详细的说明，以帮助本领域技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。