[发明专利]一种猪子宫内膜来源的外泌体及其提取方法与应用

权利要求书

1.一种猪子宫内膜来源的外泌体的提取方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）猪屠宰后取出子宫，在待取子宫角的两侧系紧，以确保子宫腔密闭，清洗后沿纵轴切开子宫角，暴露子宫腔；将子宫内膜组织从子宫肌层上分离，并将子宫内膜组织剪碎成组织块；

（2）用含1%（v/v）antibiotic-antimycotic、0.002mg/ml两性霉素B和0.05mg/ml庆大霉素的无菌DPBS冲洗步骤（1）中剪碎后的组织块以去除杂质，然后在25℃，90g条件下离心5min，弃上清液；

（3）将步骤（2）中离心弃上清液后的组织块置于Hanks’ Balanced Salt Solution中，在37℃，5%CO₂的条件下孵育24h，收集猪子宫内膜培养液；

（4）将步骤（3）收集的猪子宫内膜培养液采用超速离心法提取外泌体，得到猪子宫内膜来源的外泌体；

步骤（1）中所述的组织块的大小为1～5mm³大小；

步骤（4）中所述的超速离心法的具体操作为：

①将收集的子宫内膜培养液在4℃，2000g的离心条件下离心20min，收集上清液；

②将步骤①收集的上清液在4℃，10000g的离心条件下离心30min，收集上清液；

③将步骤②收集的上清液在4℃， 120000g的离心条件下离心2h，弃上清液，收集沉淀；

④将步骤③收集的沉淀用DPBS重悬，再次在4℃，120000g的离心条件下离心2h，弃上清液，所得到的沉淀即为子宫内膜来源的总外泌体。

2.根据权利要求1所述的猪子宫内膜来源的外泌体的提取方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的清洗的具体操作为：

先用体积分数为75%的酒精清洗2～3次，再用含1%（v/v）antibiotic-antimycotic、0.002mg/ml两性霉素B和0.05mg/ml庆大霉素的生理盐水冲洗2～3次，最后用含1%（v/v）antibiotic-antimycotic、0.002mg/ml两性霉素B和0.05mg/ml庆大霉素的无菌DPBS冲洗1～2次。

3.权利要求1~2任一项所述的提取方法制得的猪子宫内膜来源的外泌体在制备胚胎体外培养添加剂中的应用，其特征在于：

所述的胚胎体外培养添加剂为促进胚胎滋养层细胞增殖产品。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于包含如下步骤：

将胚胎滋养层细胞接种到含有权利要求1~2任一项所述的提取方法制得的猪子宫内膜来源的外泌体的培养基中培养24～48h。