[发明专利]一种酶联标签短肽及其应用

说明书

本发明公开了一种酶联标签短肽，其特征在于，其短肽序列如SEQ ID NO.1‑2所示。该短肽可以快速化学合成并且被连接酶PafA催化标记到邻近蛋白的赖氨酸位点上，从而实现蛋白质的体外标记，获得具有不同功能和特性的蛋白质。

技术领域

本发明属于蛋白质表面标记技术领域，具体涉及一种新型的酶联标签短肽及其应用。

背景技术

蛋白质的体外标记是一种应用十分广泛的生物学技术，而利用生物酶来介导蛋白质的修饰相较化学修饰，特异性更佳。蛋白质的酶促修饰可用于创建抗体-药物偶联物，引入用于成像目的的荧光基团，检查蛋白质折叠和相互作用以及研究天然的翻译后修饰。

常用的蛋白质修饰酶有BirA等，但大部分修饰酶都需要在被标记的蛋白上融合相对应的能被修饰的序列，这给某些应用带来了困难。例如，在研究过程中使用的抗体蛋白很多情况下是由免疫动物产生，并没有鉴定序列并衍生出成熟的体外表达系统，无法便捷的进行被标记序列的融合。

PUP-IT(Pupylation-based interaction tagging)利用了细菌中的Pup连接酶PafA，通过将邻近蛋白标记上小分子蛋白Pup(包含64个氨基酸的小蛋白质)来实现对蛋白质相互作用的捕捉。PUP-IT系统不但能对临近蛋白进行标记，而且能够捕捉到蛋白质之间微弱的相互作用。

先前已有报道称，Pup的C端28个氨基酸足以进行PafA介导的标记，但是当Pup被进一步截短至22个氨基酸时，即使在非常高的浓度下也无法再触发反应(Liu,Q.；Zheng,J.；Sun,W.；Huo,Y.；Zhang,L.；Hao,P.；Wang,H.；Zhuang,M.,A proximity-tagging system toidentify membrane protein-protei)。PUP-IT系统不依赖于被标记蛋白的改造，然而标记片段远远大于已有的蛋白修饰酶系统，有可能会造成被标记蛋白功能的改变。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种酶联标签短肽及其应用，该短肽可以快速化学合成并且被连接酶PafA催化标记到邻近蛋白的赖氨酸位点上，从而实现蛋白质的体外标记，获得具有不同功能和特性的蛋白质。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种酶联标签短肽，其特征在于，其短肽序列如SEQ ID NO.1-2所示。

优选地，所述短肽N端修饰有生物素或荧光团。

本发明还提供了上述酶联标签短肽的应用。

优选地，所述应用为PafA介导上述酶联标签短肽用来标记抗体。

更优选地，所述应用包括以下步骤：

步骤1：将目的蛋白(PG)与连接酶PafA融合表达，体外纯化或转染到细胞中表达；

步骤2：加入体外合成的生物素标记的酶联标签短肽，室温反应；

步骤3：免疫印迹分析检测蛋白标记结果。

本法明的新型酶联标签短肽(肽4.1)中，E52和R56突变为脯氨酸，可能破坏螺旋结构，从而使肽处于更扩展的构象。反过来，原本面向溶剂侧但突变为异亮氨酸的E53可以从α螺旋结构中释放出来，从而促进酶与肽之间的疏水相互作用。肽4.1是一种新近鉴定的较短的肽，可被PafA酶用于赖氨酸结合。与野生型肽不同，肽4.1不包含任何赖氨酸残基，因此不会形成不需要的支链修饰。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明将PUP-IT的底物进行了工程改造，使其更为短小，但又保留了原有活性，这使得蛋白质的体外标记更为容易和有效。

附图说明