[发明专利]一种里氏木霉工程菌及其制备方法和应用

说明书

本发明公开一种里氏木霉工程菌及其制备方法和应用。本发明的里氏木霉工程菌可高效表达内切葡聚糖酶，在优化条件下，里氏木霉工程菌表达的内切葡聚糖酶胞外酶活达到31.46U/mL，是野生菌内切葡聚糖酶酶活4.12U/mL的7.6倍，是大肠杆菌表达酶活13.6U/mL的2.3倍；里氏木霉表达的内切葡聚糖酶对SDS耐受性较高，特别在0.5％SDS中，tEgh31酶残余酶活接近55％，而原核表达的rEgh31残余酶活约为30％；且里氏木霉表达的tEgh31酶的比活力(161.2U/mg)较原核表达的rEgh31酶比活力(135.7U/mg)提高约19％。这表明真菌表达的内切葡聚糖酶具有较为广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种里氏木霉工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

真核生物所产生的酶与原核生物产生的酶在最适pH、最适温度等反应条件和催化机制方面存在差异。里氏木霉是丝状真菌的一种，是多细胞的真核微生物。里氏木霉表达系统具有表达水平高，可分泌表达，可高密度发酵等优点，目前在酶的工业生产中得到广泛的应用。

根据启动子功能的不同，里氏木霉表达系统可分为组成型表达系统及诱导型表达系统(高云，2002)。组成型启动子常对应于细胞中进行基本生命活动必须的基因，它们的合成速率不受代谢、环境、时空的影响；诱导性启动子与之相对，在特定条件下才能启动表达。常用的组成型启动子有甘油醛3-磷酸脱氢酶(GPDA)启动子等，常用的诱导性启动子有外切型β-葡萄糖甘酶(CBHI)启动子等。Miettinen-Oinonen等(2002)利用CBHI强启动子成功表达了内切葡聚糖酶EGI；Wang等(2004)将内切葡聚糖酶eg3基因整合到里氏木霉染色体上，并利用CBHI强启动子对该基因的表达进行调控，获得了活性较高的重组酶。本课题组冯飞等(2014)构建了由里氏木霉丙酮酸脱羧酶(PDC)的启动子、纤维二糖水解酶CBHI的信号肽、eg4基因和pdc终止子依次连接而成的表达盒，成功实现了61家族糖苷水解酶在里氏木霉中的高效表达。

里氏木霉主要产酸性纤维素酶，来源于细菌的中性、碱性纤维素酶因pH适应性问题难以在里氏木霉表达系统中高效表达，目前关于内切葡聚糖酶在里氏木霉中的组成型表达的报道极少，而怎么利用强启动子Ppdc实现细菌内切葡聚糖酶Egh31在里氏木霉中的组成型表达是亟待需要解决的问题。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种里氏木霉工程菌。

本发明的另一目的在于提供上述里氏木霉工程菌的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述里氏木霉工程菌的应用。

本发明成功的将来源于原核细菌链霉菌的内切葡聚糖酶基因在里氏木霉表达系统进行了高效的组成型表达，酶学性质研究也显示出真菌重组酶制剂在工业中的可能存在一些优势。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种里氏木霉组成型表达盒，所述表达盒由里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因的组成型强启动子(Ppdc)、里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ基因(cbhⅠ)的信号肽基因、外源目的基因(内切葡聚糖酶基因egh31)和里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因终止子(Tpdc)组成，简称为Ppdc-cbhⅠ-egh31-Tpdc；

其中，所述的里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因的组成型强启动子(Ppdc)、里氏木霉丙酮酸脱羧酶基因终止子(Tpdc)，均在“201110196079.6、里氏木霉组成型表达盒、表达载体、重组菌株及其应用”中公开，依次如201110196079.6中的SEQ ID NO.1、2所示。

所述的里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ基因(cbhⅠ)的信号肽基因的核苷酸序列如SEQID No：1所示。