[发明专利]一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法

权利要求书

1.一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将出发棒杆菌接种于LBG液体培养基中，在最适温度下进行培养，测定出发棒杆菌在最适生长温度下的比生长速率χ₀，即μ＝χ₀；

(2)将步骤(1)中生长至对数生长中后期的出发棒杆菌接种至新鲜LBG液体培养基中，并在34-36℃进行培养，测定菌株在34-36℃下的比生长速率μ＝χ₁；进一步将上述生长至对数生长中后期的菌株接种至新鲜LBG液体培养基中，并在34-36℃进行培养，测定菌株在34-36℃下的比生长速率μ＝χ₂；重复上述步骤，直至菌株在34-36℃下比生长速率μ≈χ₀，得到在34-36℃下正常生长的突变菌株；

(3)采用步骤(2)相同方法，以步骤(2)得到的在34-36℃下正常生长的突变菌株为出发菌株，诱导在39-41℃下正常生长的突变菌株；

(4)采用步骤(2)相同方法，以步骤(3)得到的在39-41℃下正常生长的突变菌株为出发菌株，诱导在44-46℃下正常生长的突变菌株；

(5)以步骤(4)得到的在44-46℃下正常生长的突变菌株为宿主菌，异源表达α-淀粉酶基因，得到能够表达α-淀粉酶的重组菌；

(6)以淀粉作为唯一碳源，利用步骤(5)得到的重组菌发酵生产L-亮氨酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的棒杆菌为谷氨酸棒杆菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的培养是在28-32℃，100-150r/min转速下培养。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述的培养是在100-150r/min转速下培养。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述的α-淀粉酶基因来源于解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述的发酵的具体步骤为：将重组菌单菌落接种至LBG培养基中培养至对数期，将种子培养液转接至改良发酵培养基进行发酵生产L-亮氨酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的改良发酵培养基为：可溶性淀粉40-50g/L，(NH₄)₂SO₄ 10-20g/L，CH₃COONH₄ 10-20g/L，KH₂PO₄ 2-4g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-1.5g/L，MnSO₄·4H₂O 0.05-0.15g/L，柠檬酸钠2-4g/L，尿素2-5g/L，L-蛋氨酸0.5-1.5g/L，L-谷氨酸0.5-1.5g/L，L-异亮氨酸0.05-0.15g/L，盐酸盐甜菜碱1-2g/L，生物素0.0003-0.0008g/L，硫胺素0.0005-0.0010g/L，CaCO₃ 30-50g/L。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，种子培养阶段的培养条件为：培养温度为44-46℃，转速为100-150r/min，培养时间为10-14h。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将种子培养液转接至发酵培养基的接种量为5-15％。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵阶段的培养条件为：培养温度为44-46℃，转速为100-150r/min，培养时间为60-80h。