[发明专利]一种烯酸还原酶的突变体蛋白及其应用

说明书

本发明涉及一种烯酸还原酶的突变体蛋白及其应用。该烯酸还原酶的突变体蛋白是基于由凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans 36D1)烯酸还原酶基因，运用易错PCR与半理性设计方法，通过随机突变与定点突变，经定向进化而获得；当该序列包含位于野生型ER‑BC的如SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的沿5′端到3′端方向的氨基酸突变子p.Ser109Asn、p.Gly111Asp、p.Leu181Pro、p.Ile187Asn、p.Phe207Tyr、p.Phe229Ile、p.Gly531Ser中的一个或几个时，该烯酸还原酶突变体的酶活力较出发菌株呈现显著提高。

技术领域

本发明属于酶的定向进化改造和生物催化应用技术领域，涉及一种烯酸还原酶的突变体蛋白及其应用。

背景技术

己二酸常用作合成尼龙6.6的中间体，是最重要的二元羧酸之一。据估计到2022年时，全球的己二酸市场将达到80亿磅，因此己二酸具有的商业价值不容小觑。目前生产己二酸普遍还是通过石油化工路线，如硝酸催化KA油(环己醇/环己酮混合物)的氧化进行化学合成，在合成过程中会产生大量的N₂O，其造成的温室气候影响比CO₂高298倍。己二酸生产造成的N₂O排放占工业总N₂O排放的80％左右，其工业减排潜力约占96.2％，使用绿色可再生原料生产己二酸可以有效地降低生产过程所带来的环境污染。生物基己二酸由于没有可靠的天然的合成途径，需要以基因工程和代谢工程的手段整合外源基因从而构建人工合成己二酸途径，但是到目前为止利用生物法合成己二酸在经济上看仍然是不可行的。对于构建热力学可行且经济可行的绿色生物己二酸途径还需要更多的努力。

生物法己二酸途径主要有两种：(1)生物合成己二酸前体并化学转化，研究较多的有顺，顺-粘康酸和葡萄糖酸的累积；(2)全生物合成，其中反向己二酸降解途径、β-氧化或逆β-氧化与ω-氧化途径结合、2-氧代庚二酸途径都是已经证明可行的方法(Karlsson，Emma，et al.Biotechnology advances 2018；Deng，Yu，Lizhou Ma，and YinMao.Biochemical engineering journal 2016：16-26；Polen，Tino，Markus Spelberg，etal.Journal of biotechnology 2013：75-84.)。

全生物合成中还存在一些尚未证实的理论途径，2-氧代己二酸途径就是其中一个，已经发现2-羟基己二酸、2-羟基己二酰CoA和2-己二酰CoA作为中间体将2-氧代己二酸转化为2-烯己二酸的酶催化途径(Parthasarathy，Anutthaman，et al.Biochemistry50.17(2011)：3540-3550.)。近期又证实了6种来自梭菌的烯酸还原酶(ERs)在大肠杆菌中表达后，其中5种具有催化2-烯己二酸到己二酸的活性，其中来自凝结芽孢杆菌的烯酸还原酶(enoate reductase from Bacillus coagulans，简称为ER-BC)具有最高的酶活，为2.3±0.04U.mg^-1，(Ress T，HummelW，Hanlon S.P，etal.ChemCatChem 2015，7，1302-1311)。烯酸还原酶较低的催化活性将会限制2-氧代己二酸途径合成己二酸的产量，若想获得高酶活或高催化效率的烯酸还原酶ER-BC，需要进一步对其进行定向进化改造。但是ER-BC的晶体结构、活性位点、催化机制等信息还尚未有报道，将会对烯酸还原酶定向进化的工作带来很大的阻碍。

因此，目前存在的问题是需要研究开发一种高酶活或高催化效率的烯酸还原酶ER-BC。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有的烯酸还原酶ER-BC对2-烯己二酸催化效率低的问题，提供一种烯酸还原酶的突变体蛋白，其通过半理性设计进化改造，具有较高的酶活力；将该烯酸还原酶的突变体蛋白应用于催化还原烯酸类物质具有较高的催化效率。