[发明专利]一种重组酶等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法

说明书

本发明公开了一种重组酶等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法，检测副溶血性弧菌的RAA引物包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物，上游引物5’端荧光素修饰，下游引物5’端生物素修饰，得到结合试纸条端点检测副溶血性弧菌的RAA特异引物对。本发明将RAA技术与侧流层析试纸条结合，可以准确、高效地检测副溶血性弧菌，灵敏度比常规PCR高出十倍数量级，细菌纯培养物最低检测限可达1.89×10³cfu/ml。该方法操作简单，可用于疾病监测、临床诊断和水产品安全检测，便于基层推广使用。

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种重组酶等温扩增技术检测副溶血性弧菌的方法。

背景技术

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)是一种嗜盐性革兰氏阴性弧菌，隶属于γ-变形菌纲，弧菌目，弧菌科，弧菌属，广泛存在于鱼虾、贝类水产品中，在海洋和河口生态环境中的海水和海底沉积物也有分布。副溶血性弧菌污染不仅会对水产养殖造成巨大的经济损失，而且食用生的海鲜或未煮熟的水产品能引起人类肠胃炎，严重者可导致食物中毒，故也将其称为肠炎弧菌。因此，检测水产品中的副溶血性弧菌很有必要和意义。

目前，副溶血性弧菌的检测方法主要是传统培养法和PCR法。传统培养法对仪器设备的要求不高，可操作性成本低，但是耗时、低效、操作繁琐，无法满足当前检测工作的快速性要求。基于PCR技术开发的检测方法显示了高的灵敏度和特异性，但是该方法依赖PCR仪或荧光PCR仪，对操作人员要求高等限制了其在低资源环境和高爆发疫病区副溶血性弧菌的快速检测，不能满足现场快速检测的需求。

重组酶等温扩增技术(Recombinase Aided Amplification，RAA)是通过酶促反应在一定温度下实现解链、配对、延伸等过程。相较其他等温扩增技术而言，该技术所用的重组酶来源广泛，而且是具有我国自主知识产权的一项技术，不受国外专利的限制。RAA技术操作简单、价格低廉、便携式等优点更适合在非实验室环境中使用。目前，这项技术已经应用到病毒、细菌、寄生虫、园艺作物等快速检测中，然而并没有基于副溶血性弧菌toxR基因的检测方法并结合侧流层析试纸条(LF)的视觉化检测。

发明内容

为克服现有技术的上述缺陷，本发明的目的是提供一种新型重组酶等温扩增技术(RAA)结合侧流层析试纸条端点检测副溶血性弧菌的方法，可在非实验室环境中快速、灵敏以及特异性高的检测出副溶血性弧菌，在低资源环境和检测现场快速实现核酸体外扩增，摆脱仪器束缚，且降低成本。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测副溶血性弧菌的RAA引物，包括靶向toxR基因的上游引物如SEQ ID NO.1所示、下游引物如SEQ ID NO.2所示的引物对序列，或所述引物对序列的互补链序列中单条序列同源性为50％及以上的碱基序列。

进一步，如SEQ ID NO.1所示的上游引物5’端荧光素修饰，如SEQ ID NO.2所示的下游引物5’端生物素修饰，可得到结合试纸条端点检测副溶血性弧菌的RAA特异引物对。

更进一步，所述荧光素采用6-FAM，所述生物素采用Biotin。

一种检测副溶血性弧菌的RAA试剂盒，包括所述检测副溶血性弧菌的RAA引物或所述结合试纸条端点检测副溶血性弧菌的RAA特异引物对，或还包括以冻干粉形式的RAA反应组分和RAA反应缓冲液、无菌去离子水、醋酸镁和侧流层析试纸条。

一种检测副溶血性弧菌的RAA方法，包括如下步骤：提取待测样品的DNA，将所述试剂盒和待测样品基因组DNA配制RAA反应体系，并在37℃恒温扩增反应20min，在试纸条吸收垫位置做好标记，在室温条件下取10μL上述核酸扩增产物滴加到样品垫上，并将试纸条样品垫末端垂直插入含有100μL LF缓冲液的EP管中，5min后取出试纸条，观察并记录结果；其中：