[发明专利]一种定点突变的载体蛋白及其在制备疫苗中的用途

说明书

本发明涉及一种定点突变的载体蛋白及其在制备疫苗中的应用，其中所述的载体蛋白选自白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体、细菌的外膜蛋白质和细菌表达蛋白中的一种或两种以上形成的融合蛋白，其中所述载体蛋白上至少1个位点上的氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸含有叠氮基或炔基端基。本发明所述的定点突变的载体蛋白与多糖抗原相互反应过程中，形成共价键，同时结合物呈现连珠式状态，可有效避免载体蛋白与多糖抗原发生过度交联，结合物粒径分布显著均匀可控，为提高多糖蛋白结合疫苗质量提供了有效的手段。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地说，本发明涉及一种定点突变的载体蛋白及其在制备疫苗，特别是肺炎多价结合疫苗中的用途。

背景技术

由肺炎链球菌导致的感染在世界范围内是导致发病率和死亡率的主要因素之一。肺炎、发热性菌血症和脑膜炎是侵袭性肺炎链球菌疾病的最常见表现，而细菌在呼吸道内散播可导致中耳感染、鼻窦炎或者复发型支气管炎。

使用与蛋白载体连接的多糖制备多糖蛋白缀合物疫苗，多糖与蛋白载体的化学键可诱导针对在其表面上展现疫苗所包含的多糖的细菌的免疫应答，由此预防疾病，因此，使用来自致病细菌的多糖的疫苗接种是增强宿主免疫力的潜在策略。

尽管多糖自身是免疫原性的，但多糖与载体蛋白的缀合已用于改善免疫原性，载体蛋白可以是来自靶标病原体的增强对该病原体的特异性免疫应答的相关蛋白抗原，或是主要作为佐剂或一般免疫应答刺激剂的一般免疫原性蛋白。

传统的多糖蛋白结合技术，中国专利ZL02159032.X公开了一种多糖蛋白结合疫苗的制备方法，也是目前制备多糖结合疫苗最常使用的技术之一。在所述技术中，以己二酸二酰肼（ADH）作为连接剂结合多糖与蛋白。这种结合方式首先需要将多糖经溴化氰活化，即在碱性条件下用溴化氰作用于多糖分子上的羟基，形成氰酸酯，然后与ADH 反应；氰酸酯中的一个碳氧键断裂，与ADH一端的氨基发生加成反应，从而将酯酰肼（AH）基团导入多糖分子，形成多糖-AH 衍生物；多糖-AH 衍生物在碳二亚胺（EDAC）的介导下与载体蛋白形成稳定的结合物。这样的结合方式可减少多糖与载体蛋白结合的空间位阻，保留了多糖的抗原表位，同时避免了多糖本身的溶解性，减少多糖与抗血清反应的副作用，但存在一些不足之处：(1)多糖-AH衍生物会继续与溴化氰活化的多糖反应，形成多糖的自身聚合物，降低了多糖蛋白的结合效率；(2)EDAC在介导ADH 衍化多糖与载体蛋白结合的同时，容易引起载体蛋白的自身交联，从而降低多糖蛋白的结合效率，因此，多糖蛋白结合疫苗的免疫原性和抗体持效性仍有待进一步提高，如多糖结合疫苗需要免疫三次才能产生免疫效果。这些不足之处限制了多糖结合疫苗的进一步发展。

利用叠氮和炔的Click反应在生物分子体系中进行修饰是近年来研究的热门领域。Natalie W.Nairn等利用甲硫氨酸缺陷型菌在干扰素β中引入含有叠氮基团的非天然氨基酸，然后利用有铜催化的Click反应进行单位点的PEG修饰（Natalie W.Narin etal,Bioconjugate Chem.2012）。

遗传密码扩展技术，近年来遗传密码扩展技术发展迅速，利用琥珀终止密码子为有义编码子，通过引入相应的正交tRNA及氨酰tRNA合成酶，最终可以将设计好的非天然氨基酸引入蛋白质中，根据非天然氨基酸的性质，可以赋予蛋白质特殊的功能。到目前为止，这一技术已经将几十种非天然氨基酸成功地定点表达在活细胞的蛋白质当中，涉及的非天然氨基酸包括炔基和叠氮等，利用这些生物体重本来不存在的特殊基团，就可以特异性地对蛋白质进行定点修饰。面对现有技术中结合疫苗结合工艺不均一，分离纯化工艺复杂等问题，该领域迫切需要能够任意位点特异性修饰功能基团的方法。