[发明专利]一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的巢式二重PCR检测引物及试剂盒

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的巢式二重PCR检测引物组，包括外侧引物组及内侧引物组，检测引物的核苷酸序列如下所示：

外侧引物组：

ASFV-CD2V-F1：5’GATAATTTCGCCACCGCACTAG 3’（SEQ ID NO：1）；

ASFV-CD2V-R1：5’CTGTGGGCCTCATTTTTCGTT 3’（SEQ ID NO：2）；

ASFV-360-505R-F1：5’TCATTTAGAGAAGGTCATCATAGGAGC 3’（SEQ ID NO：3）；

ASFV-360-505R-R1：5’AGACTGTTGTTCACTGGTTTGAGAT 3’（SEQ ID NO：4）；

内侧引物组：

ASFV-CD2V-F2：5’TTATTGCCCTAAAGATTGGGTTGG 3’（SEQ ID NO：5）；

ASFV-CD2V-R2：5’GCTGTTTGATTTCTAGGAGAGCTTG 3’（SEQ ID NO：6）；

ASFV-360-505R-F2：5’CTATTCAACGAGCAGGAAACAACT 3’（SEQ ID NO：7）；

ASFV-360-505R-R2：5’TACACCATACTGAACCTAGCTTTCC 3’（SEQ ID NO：8）。

2.一种非疾病诊断目的的区分非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的巢式二重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的检测引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括DNA提取试剂和PCR扩增试剂。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品为包含非洲猪瘟病毒CD2V基因的质粒DNA；所述阴性对照品为去离子水。

5.一种非疾病诊断目的的巢式二重PCR鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与CD2V和/或360-505R基因缺失株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.从样品中提取病毒核酸；

S2.以步骤S1中提取的核酸为模板，用权利要求1中所述的外侧引物组对样品进行第一次二重PCR扩增反应获得扩增产物A；

S3.以步骤S2中扩增产物A为模板，用权利要求1所述的内侧引物组对样品进行第二次二重PCR扩增反应获得扩增产物B；

S4.将步骤S3中PCR扩增产物B进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S4所述确定病毒类型的方法为：

当无扩增产物时，则样品中没有非洲猪瘟病毒；

当扩增产物为一条片段，大小为1637bp，则样本中的病毒为野毒株；

当扩增产物为两条片段，大小分别为553bp和239bp，则样本中的病毒缺失CD2V和360-505R基因；

当扩增产物为三条片段，大小分别为1637bp，553bp和239bp，则样品中为CD2V和360-505R基因缺失毒株和野毒株混合感染。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S2所述第一次二重PCR扩增反应的反应体系包括：2×Premix 10μL，20μM ASFV-CD2V-F1/R1、10μM ASFV-360-505R-F1/R1各1μL，模板DNA 1μL，补加去离子水至20μL。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S3所述第二次二重PCR扩增反应的反应体系包括：2×Premix10μL，20μM ASFV-CD2V-F2/R2、10μM ASFV-360-505R-F2/R2各1μL，模板DNA 1μL，补加去离子水至20μL。