[发明专利]一种来源于单增李斯特菌的重组氨基肽酶T及应用

权利要求书

1.一种来源于单增李斯特菌的重组氨基肽酶T，其特征在于，该氨基肽酶T的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.用于编码权利要求1所述重组氨基肽酶T的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求2所述基因的制备方法，其特征在于，包括：以单增李斯特菌EGD-e NC_003210的基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应进行基因扩增，获得目的基因；扩增过程中所用引物如下：

上游引物：GCGCATATGAGAGATGCAAGAATCGAAAAATTAGCA

下游引物：CCGCTCGAGTACTAAGTTTTCTGGATTAAGTGCTTCTAATTCT

其中，上游引物下划线部分为Nde I酶切位点，下游引物下划线部分为Xho I酶切位点。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，

扩增所用的PCR体系为：

KOD plus buffer 10μl；上游引物和下游引物各2μl，10mM；DNA模板2μl和ddH₂O66μl；MgSO₄ 6μl；dNTP 10μl；KOD-plus-Neo 2μl；

PCR扩增步骤为：(1)94℃，预变性2min；(2)98℃，变性10s；(3)56℃退火30s；(4)68℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)68℃继续延伸7min，冷却至4℃；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。

5.权利要求2所述重组氨基肽酶T基因的重组表达载体的制备方法，其特征在于包括：

将氨基肽酶T的基因在37℃条件下用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切2h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段；将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，与同样经Nde I Xho I酶切后的质pET30在16℃下连接4-5h；之后转化至大肠埃希氏菌E.coli.DH5α感受态细胞，通过菌液PCR筛选阳性克隆，提取质粒，即为氨基肽酶T基因的重组表达载体，命名为pSL327。

6.权利要求2所述重组氨基肽酶T基因的重组表达转化体的制备方法，其特征在于包括：

(1)重组表达载体的制备

将氨基肽酶T的基因在37℃条件下用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切2h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段；将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，与同样经Nde I Xho I酶切后的pET30质粒在16℃下连接4-5h；之后转化至大肠埃希氏菌E.coli.DH5α感受态细胞，通过菌液PCR筛选阳性克隆，提取质粒，即为氨基肽酶T基因的重组表达载体，命名为pSL327；

(2)重组表达转化体的制备

将重组表达载体的质粒转化到大肠埃希氏菌E.coli.Rosetta感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，培养后获得重组表达转化体，命名为E.coli.Rosetta-pSL327。