[发明专利]一种金枪鱼鱼精蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种金枪鱼鱼精蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)预处理：金枪鱼精巢室温解冻、匀浆，以乙酸乙酯浸泡，间歇性高速搅拌24h，过滤烘干，最后粉碎；

2)盐匀浆：金枪鱼鱼精干燥粉末中加入0.1～0.12MNaCl和0.08～0.12M柠檬酸钠的混合溶液，均质匀浆后低速搅拌，静置后高速离心分离并取沉淀；

3)酸解：在步骤2)的沉淀物中加入硫酸溶液提取，0℃下以4800～6000r/min离心10min，上清液过滤；用三倍体积的冷乙醇沉淀，沉淀用丙酮洗涤两次，冷冻干燥，得鱼精蛋白粗品；

4)纯化：鱼精蛋白粗品配成溶液注入CM Sephaorse CL-6B，以含有NaCl的CH₃COOH-CH₃COONa溶液进行线性梯度洗脱，以4mL/管收集，合并每次收集的相同洗脱峰，透析除盐24h后，减压旋蒸，冷冻干燥即得鱼精蛋白纯品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)预处理中，间歇性高速搅拌具体是以5000～12000r/min速度搅拌45～60min，然后停止搅拌1h，继续高速搅拌-停止并完成24h。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2)盐匀浆中，金枪鱼鱼精干燥粉末中加入含NaCl和柠檬酸钠的混合溶液后，均质匀浆1min，60～120r/min低速下搅拌20min，静置10min后，4000～8000r/min高速下离心分离10min，弃去上清液。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：步骤2)盐匀浆中，所有操作均在0℃温度下进行。

5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：

沉淀物与硫酸溶液的料液比是1:5～8，和/或

硫酸溶液的浓度是0.35～0.45M。

6.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：步骤4)纯化中，含有NaCl的CH₃COOH-CH₃COONa溶液中CH₃COOH-CH₃COONa的浓度是0.8～2.0M，NaCl的含量是0.12～0.22M。

7.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于：步骤4)纯化的具体操作是：取鱼精蛋白液注入CM Sephaorse CL-6B，待溶液进入层析柱后，缓慢加入现配的CH₃COOH-CH₃COONa缓冲液，用此缓冲液冲洗至检测仪记录线回到基线后；再以新鲜配制的0.8～2M的含有NaCI的CH₃COOH-CH₃COONa溶液进行线性梯度洗脱，设定自动收集器以4mL/管收集，合并每次收集的相同洗脱峰，透析除盐24h后，减压旋蒸，冷冻干燥备用。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤4)纯化前需进行下述准备操作：将CMSephaorse CL-6B试剂摇匀，倒入约250mL烧杯中，用纯水抽滤掉多余液体，并倒入200mL的0.5MNaOH溶液中浸泡30min，然后用纯水抽滤洗至中性，再用纯水洗至抽滤瓶中，抽气泡1h,之后将CM Sephaorse CL-6B装入层析柱(Φ1.0cmx30cm)，最终柱体积约为30Ml，用25mMCH₃COOH-CH₃COONa缓冲液平衡1～3柱体积后，将层析柱与在线紫外检测仪、自动收集器相连(λ220nm)，流速为2mL/min。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：对步骤4)纯化后得到的鱼精蛋白纯品进行Tricine-SDS-PAGE电泳和坂口反应检测后，确认了Ⅲ组分为鱼精蛋白，分子量在6.5～21.1kD；其氨基酸组成中氨基酸总量为76.90％±0.37％，碱性氨基酸含量较高，为38.99％±0.27％。

10.一种金枪鱼鱼精蛋白，其特征在于所述金枪鱼鱼精蛋白由权利要求1～9任一项所述方法制备得到。