[发明专利]一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法

说明书

本发明提供了一种临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法，包括以下步骤：S1、血液中肺炎克雷伯菌基因组DNA的提取；S2、血液中肺炎克雷伯菌PCR检测：S2.1、利用肺炎克雷伯菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物；引物所扩增的目的片段长度为411bp；S2.2、以步骤S1中从血液中提取的肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板，采用特异性的PCR引物进行PCR扩增；S2.3、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为411bp的片段则判定为检测出肺炎克雷伯菌病原菌。本发明对血液中肺炎克雷伯菌的检测极限达到10CFU/mL。本发明不仅提高了血液中肺炎克雷伯菌感染的检测灵敏度，而且缩短了检测周期。

技术领域

本发明涉及血液感染病原菌的检测技术领域，具体涉及一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法。

背景技术

肺炎克雷伯菌是一种革兰氏阴性菌，已成为医院获得性感染的重要条件致病菌之一。肺炎克雷伯菌导致的血流感染在革兰氏阴性菌引起的血流感染中位列前茅。肺炎克雷伯菌引起的血流感染不仅伴随着多种如肺炎感染等的并发症，而且具有极高的发病率和死亡率。

目前，针对临床血液中肺炎克雷伯菌的检测，传统的院内检验方法需要经过24-48h的菌种培养步骤，再到后续的生理生化或耐药性分析等，会经过一系列耗时和复杂的中间检测步骤。这种临床传统检测方法往往会错过已感染病人的及时诊断，而不能实时地为临床医师提供用药指导，从而错过感染病人的最佳治疗时间。所以，寻找一种快速简单和高效率的检测血样中肺炎克雷伯菌的方法具有重大的临床意义和广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法，解决了医院传统的临床血液中肺炎克雷伯菌感染检测周期长的技术局限，同时在检测效率上也有了较大的提升；本发明为简单快速、特异和高效的临床血液检测肺炎克雷伯菌感染的方法，首先简单快速地提取出血样中肺炎克雷伯菌的基因组DNA；再利用待测肺炎克雷伯菌的特异基因设计特异性PCR扩增引物，通过PCR反应快速高效地检测出临床血液中肺炎克雷伯菌感染。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

一种从临床血液中检测肺炎克雷伯菌病原菌的方法，包括以下步骤：

S1、血液中肺炎克雷伯菌基因组DNA的提取；

S2、血液中肺炎克雷伯菌PCR检测：

S2.1、利用肺炎克雷伯菌基因组DNA序列设计一段特异性的PCR引物，该特异性的PCR引物包括如SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物；其中，

SEQ ID NO.1：5’-GTTGTTCCCGTTATGTCTGGTGC-3’；

SEQ ID NO.2：5’-GCTATCAGCGCCACGTTAGC-3’；

引物所扩增的目的片段长度为411bp；

S2.2、以步骤S1中从血液中提取的肺炎克雷伯菌基因组DNA为模板，采用步骤S2.1中的特异性的PCR引物进行PCR扩增；

S2.3、对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及检测，扩增出长度为411bp的片段则判定为检测出肺炎克雷伯菌病原菌。

优选地，步骤S1中，血液样品中肺炎克雷伯菌病原菌基因组DNA的提取具体包括以下步骤：

S1.1、血液样品与酶裂解液等体积混合混匀，37℃孵育15分钟；

S1.2、步骤S1.1中酶裂解液处理的血液样品与碱裂解液等体积混合，轻轻混匀，室温静置裂解5分钟；