[发明专利]血浆外泌体tRFs标志物及其在乳腺癌诊断中的应用

说明书

本发明公开了一种血浆外泌体tRFs标志物及其在乳腺癌诊断中的应用，标志物是外泌体来源的tRF‑Ser‑AGA‑018，其应用操作步骤：A.建立统一标准的标本库和数据库，以标准操作程序采集符合标准的血液样本和组织样本，系统收集完整的纳入人群的临床资料；B.血液中肿瘤源性外泌体来源的tRFs差异表达谱分析，选择乳腺癌病例和健康人的血浆样本，以及乳腺癌癌组织和癌旁组织，提取外泌体，进行tRFs和tiRNA测序，筛选出差异表达的tRFs；C.对已筛选的差异表达tRFs在大样本人群中进行QRT‑PCR定量分析。本发明血液中肿瘤源性外泌体的tRFs是一种新型生物标志物，稳定、微创、实时监测，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类非编码RNA生物标志物的成功开发有助于乳腺癌诊断。

技术领域

本发明涉及乳腺癌诊断领域，特别是涉及一种血浆外泌体tRFs标志物及其在乳腺癌诊断中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率居我国女性恶性肿瘤之首，成为威胁女性健康的“头号杀手”。早期乳腺癌不易发现，往往出现明显病理症状才就诊，尽管手术、放化疗、内分泌治疗以及生物治疗等综合治疗使乳腺癌患者的长期生存率有所提高，但总生存率仍不理想。因此提高乳腺癌的诊断及疗效监测水平是提高治疗效果和延长生存时间的关键。理想的乳腺癌生物标志物应具有特异性高、敏感性高、无创性和实用性的特点，能够对乳腺癌发生发展进行监测，同时减少创伤及患者的负担。

目前，对乳腺癌的筛查和治疗监控主要通过检测血清学肿瘤标志物如糖类抗原CA153、CA50以及癌胚抗原(CEA)等，存在灵敏度性不高，特异性较差等问题。而循环肿瘤DNA(ctDNA)和循环肿瘤细胞(CTC)虽然大幅度提高灵敏度，但其含量受到血液及淋巴循环对其清除、降解等影响，存在检出率低、来源复杂、特异性差等缺点，易出现假阳性。因此，发现新的高特异性、高敏感性的乳腺癌生物标志物，不仅为临床抗癌靶向治疗及预后判断提供理论依据，还为降低有创检查的频率奠定基础。

液体活检是一种非侵入性的液体检测，可以反复监测临床肿瘤的技术，可从分子层面对肿瘤获得更加广泛的认识，可以提供癌症病变所有的遗传图谱(包括原位癌和转移癌)，同时可以为系统跟踪基因进化提供机会。外泌体是一种直径为30～160nm的胞外囊泡结构，是液体活检技术中一项非常关键的研究材料，可以用于精准医疗。它是由细胞内多囊泡体(multivesicular body,MVB)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的脂质双分子膜包裹的小囊泡。外泌体被周围肿瘤细胞或其他效应细胞摄取，能够改变靶细胞状态，参与肿瘤的发生发展。且肿瘤细胞与微环境之间能够通过包裹遗传物质和信号的外泌体进行细胞之间的“通讯”。与ctDNA、CTC相比，外泌体具有数量多、更易富集、外有被膜、所转运的物质不易降解、在体内的传递信息具有广泛性等优势，是目前最为理想的液体活检的分析材料。

外泌体携带丰富的生物学分子，特别是大量的遗传物质，如DNA片段、mRNA、长链非编码RNA(IncRNA)、小RNA(small RNA)等等。其中转移核糖核酸(transfer RNA，tRNA)衍生片段(tRNA-derived RNA fragment，tRF)，占外泌体所含核酸物质的15％，是丰度最高的小分子RNA之一。tRFs是在某些特定情况下，由成熟tRNA或前体tRNA被特异性剪切所产生。tRFs的重要性在近几年才逐渐被发现，越来越多的证据显示，其与InRNA的复杂调控机制、cfDNA繁复的突变位、mRNA的不稳定性相比，tRFs具有相对稳定不降解的特性，其具有类似mRNA功能，能够影响调控基因的功能，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等生物学过程，同时还能结合蛋白质影响miRNA的稳定性

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)血清学肿瘤标志物如糖类抗原CAl53、CA50以及癌胚抗原(CEA)等，存在灵敏度性不高，特异性较差等问题；