[发明专利]一种同时检测3种病毒的Taqman探针荧光定量PCR试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种同时检测3种病毒的Taqman探针荧光定量PCR试剂盒及方法，涉及分子生物技术领域。所述3种病毒为：非洲猪瘟、非洲马瘟及西尼罗病毒；所述试剂盒包括PCR反应液；所述PCR反应液包括3组引物对和3组探针。所述试剂盒可快速、准确的检测出非洲猪瘟、非洲马瘟、西尼罗病毒，且灵敏性达到10¹拷贝数、与牛呼吸道合胞体病毒、牛冠状病毒和牛传染性鼻气管炎病毒特异性较好，其稳定性在4℃、37℃、室温条件下放置6个月后依然较好。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种同时检测3种病毒的Taqman探针荧光定量PCR试剂盒及方法。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus，ASFV)感染家猪和各种野猪(非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。

非洲马瘟是由非洲马瘟病毒引起的马属动物的一种急性或亚急性传染病。以发热、皮下结缔组织与肺水肿以及内脏出血为特征，只能通过昆虫传播。马对此病的易感性最高，病死率高达95％。本病发生有明显的季节性和地域性，多见于温热潮湿季节，常呈地方流行或暴发流行，传播迅速；厚霜、地势高燥、自然屏障等影响媒介昆虫繁殖或运动的气候、地理条件，将使本病显著减少。

西尼罗病毒属于黄病毒科黄病毒属，与乙型脑炎、圣路易脑炎、黄热病、登革热、丙型肝炎等病毒同属。有囊膜，单链线形核糖核酸，RNA为正链，约有10000～11000个碱基对，具有感染性。电镜下该病毒呈中等大小，直径21nm～60nm,圆形颗粒，对有机溶剂，紫外线敏感。

实时荧光定量PCR(Real-time Fluorescence Quantitative PCR，qPCR)，该方法与传统方法不同，它的优点：一是单管封闭操作，有效解决了PCR污染问题；二是自动化程度高；三是特异性更强；四是PCR反应的实时监控。有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果；五是绝对定量，由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行绝对定量测定。Taqman探针法，可进行多重基因检测，其扩增的原始图能直观反映真实的扩增效率。可满足同一反应管检测多种核酸序列的要求。目前对上述病毒的检测所采用的方法主要为PCR检测方法。PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于它的特异性、敏感性高，能在短时间内得到大量的目的片段，使之成为当今发明研究的重要手段之一。但目前尚未公开Taqman探针采用荧光定量PCR方法同时检测3种病毒(非洲猪瘟、非洲马瘟及西尼罗病毒)的文献。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例提供了一种同时检测3种病毒的Taqman荧光定量PCR试剂盒及方法，主要目的是实现快速、准确同时检测出非洲猪瘟、非洲马瘟及西尼罗病毒。

为达到上述目的，本发明主要提供了如下技术方案：

一方面，本发明实施例提供了一种同时检测3种病毒的Taqman探针荧光定量PCR试剂盒，包括PCR反应液；

所述3种病毒为：非洲猪瘟、非洲马瘟及西尼罗病毒；

所述PCR反应液包括3组引物对和3组探针；

用于检测非洲猪瘟的引物对和探针核苷酸序列为：

PF_ASFV：5’-CTACTCACCACGCAGAGATAAG-3’；