[发明专利]一种定点突变改造的裂解性多糖单加氧酶及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种定点突变改造的裂解性多糖单加氧酶及其构建方法与应用，属于基因工程领域。所述酶的活性在纤维素的结晶多糖降解中提供降解功能。本发明所述裂解性多糖单加氧酶突变体，是由野生型嗜热毁丝霉的裂解性多糖单加氧酶的氨基酸序列基础上，发生第34位由Arg突变为Leu，该突变酶和野生酶的最适温度都为85℃，突变酶的比活力比野生酶显著提高2倍左右，且在pH大于5.5时，突变酶的比活力较野生酶显著高出2倍左右。以微晶纤维素为底物时，纤维素酶与突变酶的协同反应所产葡萄糖含量较以纤维素酶单独降解底物显著提高了48.5％，可以看出突变酶显著提高了酶活力，可以降低工业应用的经济成本。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种定点突变方法制备裂解性多糖单加氧酶突变体。

背景技术

虽然我国已经成为世界第二大经济体，但是依然面临着能源、资源和环境的挑战。石油资源面临枯竭，寻求可替代能源的再生资源急不可耐。生物乙醇是可再生且碳中性的生物液体燃料，可以缓解能源紧张的问题。所以从生物质提取乙醇一直是政府支持的重点。第一代从淀粉或糖中提取的生物燃料已经是一种成熟的技术，但由于它们对食物资源的依赖，加上缺乏足够的资源来满足未来的能源需求，所以意味着需要寻找替代能源。因此，从不可食用的木本植物中得到第二代生物燃料被认为是至关重要的。这种顽固材料主要由木质纤维素组成，包括纤维素、半纤维素和木质素，是地球上最丰富的生物聚合物。但是目前此类聚合物没有得到充分的利用，因此合理的利用这类资源将会对能源危机的缓解至关重要。

纤维素是木质纤维素中含量最丰富的组分，其降解后的组分单糖是发酵生成乙醇的主要成份。纤维素中的多糖主要是结晶多糖的形式存在，目前的纤维素酶对于降解此类结晶多糖的效率很低，因此时间和经济成本较高，限制了此类物质的再利用。最近发现的裂解性多糖单加氧酶(Lytic Polysaccharide Monooxygenases：LPMOs)的发现改变了这一现状，其作用于结晶多糖时，不仅能结合于多糖表面，还能通过氧化作用的方式断裂多糖的糖苷键，使得多糖的结构趋于松散，为之后酶的水解提供基础。然后再通过发酵生成生物乙醇，它开辟了采用可持续原料生产生物乙醇的新的可能性。LPMOs是一类新发现的铜离子依赖性的氧化酶，常具有多种模块化组合，能够高效氧化降解生物质多糖。近年来的研究表明，在木质纤维素降解酶系中加入LPMOs能显著提高其对结晶纤维素的转化效率，因此高催化活性LPMOs的研发可以降低工业规模的生产成本，提高经济效益。

定点突变技术是在已知的核苷酸序列中准确改变一个或多个碱基，从而改变组成蛋白质的一个或多个氨基酸残基，以研究蛋白质结构和功能的关系。近年来，定点突变技术在基因工程改造中发挥着巨大作用，在提高酶活，改善酶的催化特征等方面取得了非常有益的效果。但是该技术在LPMOs的改造中还应用较少，尤其对于真菌LPMOs，鲜有定点突变改造的文献报道。因此，定点突变改造真菌LPMOs的研究具有极佳的理论和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于利用定点突变的方法对真菌来源的裂解性多糖单加氧酶进行改造，获得酶活性提高的裂解性多糖单加氧酶突变体，降低工业应用的经济成本。

本发明所述裂解性多糖单加氧酶突变体，

所述突变体的氨基酸序列是在如SEQ ID No.3所示野生型嗜热毁丝霉的裂解性多糖单加氧酶的氨基酸序列基础上，第34位的Arg替换为Leu。

所述裂解性多糖单加氧酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

编码权利要求1所述突变体的基因。

优选地，所述编码突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

所述裂解性多糖单加氧酶突变体的用途，在最适温度85℃和最适pH7.5条件下，所述突变体的酶活是野生型的1.88倍。

一种重组载体，含有所述突变体的编码基因。