[发明专利]一种阳离子接枝聚合物的生物酶及其制备方法和固定方法

权利要求书

1.一种接枝阳离子聚合物的生物酶的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1，聚合物的合成

称取二苯醚、引发剂、单体和五甲基二乙基三胺PMDETA并混合后，依次通过冷冻、抽真空、解冻、充填氩气的方法进行除氧，然后转移至装有CuCl和磁子的可封口容器中混合均匀，将容器置于30-50℃油浴中搅拌反应1-3h，反应结束后，液氮冷冻，立即打开容器封口，加入二氯甲烷稀释，然后将聚合物溶液过中性氧化铝柱，再用二氯甲烷洗涤中性氧化铝柱两次，滤液用旋转蒸发仪浓缩，然后浓缩液沉淀至正己烷中，反复沉淀3次，真空干燥得聚合物；

将胺类改性剂溶于无水N，N-二甲基甲酰胺DMF中，得到胺类改性剂溶液；

将聚合物PGMA溶于无水N,N-二甲基甲酰胺DMF，得到聚合物溶液；

聚合物溶液缓慢滴加入胺类改性剂溶液中，滴加完并经过反应完毕后，混合液经过透析，分子截留量3500，得到含有-NH₂的阳离子聚合物；

步骤1中所述的引发剂为溴代异丁酸单甲醚乙酯MEG-Br，单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯GMA；

步骤1中所述的胺类改性剂为乙二胺EDA，二乙烯三胺DETA，三乙烯四胺TETA或聚醚酰亚胺PEI₄₀₀中的任意一种；

步骤1中所述胺类改性剂溶液中无水N，N-二甲基甲酰胺DMF和胺类改性剂的体积比为10：1-5，得到的胺类改性剂溶液的摩尔浓度为1mmol/1.2-1.5ml；

聚合物溶液中聚合物与无水N，N-二甲基甲酰胺DMF的体积比为1-5：15；

含有-NH₂的阳离子聚合物中胺类改性剂与聚合物的摩尔比为5-7:10；

步骤2，改性生物酶和改性阳离子聚合物的合成

改性生物酶为：采用丙炔醇修饰生物酶，得到含有丙炔基的生物酶；丙炔基的生物酶为HRP；

改性阳离子聚合物为：采用叠氮钠与步骤1得到的含有-NH₂的阳离子聚合物反应，得到含有叠氮基的阳离子聚合物；含有-NH₂的阳离子聚合物为PGMA-NH₂；

所述步骤2中改性生物酶的具体合成过程为：将生物酶溶解于磷酸缓冲溶液中，生物酶和磷酸缓冲溶液的体积比为1:2-5，将丙炔醇溶液缓慢滴入到生物酶的磷酸缓冲溶液中常温下反应2-3h，超滤Mcutoff＝100kDa，即得改性生物酶；其中，丙炔醇溶液与生物酶的磷酸缓冲溶液体积比1:35-40，磷酸盐缓冲溶液PB1由磷酸氢钠溶液和NaCl溶液混合而成，其中，NaCl和磷酸氢钠的摩尔比为1:1.5，磷酸盐缓冲溶液的PH＝7.2，生物酶和磷酸缓冲溶液的体积比为1:2-5；

改性聚合物的具体合成过程为：将步骤1得到的含有-NH₂的阳离子聚合物、氯化铝AlCl₃溶于DMF中得到含有-NH₂的聚合物的DMF溶液，将NaN₃溶于H₂O中得到叠氮钠水溶液，然后边搅拌边将叠氮钠水溶液滴入到含有-NH₂的聚合物的DMF溶液中，再加入2M HCl，在40℃-60℃下搅拌反应10-12h；反应结束后减压浓缩除去DMF至之前体积的30-35％，离心除去生成的白色固体，再浓缩至之前体积的35-40％左右，离心得到透明清液并沉淀至二次蒸馏水中，得到白色沉淀，离心，再用蒸馏水洗涤沉淀5-8次，冷冻干燥得到含有叠氮基的阳离子聚合物，其中，含有-NH₂的阳离子聚合物、氯化铝AlCl₃、DMF的体积比为：1-5:1-3:12，NaN₃和H₂O的体积比1-2:5，叠氮钠水溶液和含有-NH₂的聚合物的DMF溶液的体积比3-5:10，含有-NH₂的聚合物的DMF溶液和叠氮钠溶液的总体积与2MHCl的体积比为：500-600:1；

步骤3，接枝阳离子聚合物生物酶的合成；

将步骤2含有丙炔基的生物酶与含有叠氮基的阳离子聚合物反应，即得到接枝阳离子聚合物的生物酶；

步骤3反应过程中叠氮基团和炔基比例为1:1；

步骤3的具体过程为：

量取经炔基修饰的HRP与PGMA-N₃加入MesB1缓冲溶液中，采用点击化学反应在常温反应3天，经沉淀和真空干燥得到生物酶接枝聚合物，MesB1缓冲溶液为：0.1M MES，0.15NaCl，PH＝4.7。