[发明专利]细胞核提取缓冲液及胡椒属植物基因组大小的测定方法

说明书

本发明涉及分子遗传与进化研究领域，特别涉及细胞核提取缓冲液及胡椒属植物基因组大小的测定方法。该细胞核提取缓冲液由如下组分组成：40～50mmol/L Tris‑HCl，0.8v/v％～1.5v/v％Triton X‑100，45～50mmol/L NaHSO₃，0.3w/v％～0.5w/v％PVP，水补足。本发明采用的细胞核提取缓冲液能测定出40份胡椒属资源的基因组大小，且CV值都控制在误差范围内；而其它细胞核提取缓冲液仅能检测出待测4份种质中的2‑3份，且与本发明采用的细胞核提取缓冲液相比碎片较多、峰较宽。本发明提供的细胞核提取缓冲液解决了胡椒属植物信号峰的检出效率，提高了准确性。

技术领域

本发明涉及分子遗传与进化研究领域，特别涉及细胞核提取缓冲液及胡椒属植物基因组大小的测定方法。

背景技术

胡椒属(Piper L.)植物是胡椒科(Piperaceae)重要的泛热带组成成分，是基部被子植物中最大的属之一。主要分布于南亚、南美洲、中美洲等热带和亚热带地区，约有1000多个种。胡椒属具有分化速率快的特点，是开展有花植物进化和基部被子植物快速分化机理研究的很好例子。胡椒属内有许多具有经济价值和开发潜力的资源。胡椒属植物用于传统医药已有几千年的历史，在中国、印度、拉丁美洲和西印度群岛民间广泛采用胡椒、卡瓦胡椒、石南藤等入药。在亚洲东南部，人们常将蒌叶和槟榔果连同石灰一起咀嚼帮助消化。

胡椒(Piper nigrum L.)是胡椒属多年生常绿藤本植物，是世界上重要的香辛料作物之一，素有“香料之王”的美誉。原产于印度，胡椒自1947年引入中国，目前种植面积达3万公顷，年总产量超过3万吨，位居世界第5位。胡椒是人们喜爱的调味品，在现代制药上，胡椒作为健胃剂和解热剂使用，还可广泛应用于戒烟、戒毒和军事等领域。我国胡椒种植栽培品种以热引1号(P.nigrum c.v.Reyin-1)为主，存在栽培品种单一和抗逆性弱的问题，影响了我国胡椒种植规模的扩大和胡椒产业的扩展，亟待在野生近缘种中开展资源挖掘和创新利用等工作。

胡椒野生近缘种众多，部分资源具有优良性状，例如黄花胡椒(P.flaviflorum)具有较强的抗瘟病性，大叶蒟(P.laetispicum)具有较长的花穗，石南藤(P.wallichii)具有较强的抗寒性等。但是胡椒属不同野生近缘种间基因组大小不同，而且许多种的基因组大小还不清，对利用野生近缘种创新利用造成阻碍，因此，开展胡椒属资源基因组大小估算研究可为资源创新利用提供参考。

基因组大小(C-value)是指某种生物中单倍体细胞核或配子体中的DNA含量，常用重量皮克(10^-12g)或核苷酸碱基对数量(base pair/Gb)来表示。基因组大小既与植物的生物学性状存在着较强的相关性，又与物种的进化位置有一定的关系。基因组大小测定的方法有多种，传统的有孚尔根微显影法和化学分析法，而新技术流式细胞术(Flowcytometry，FCM)具有能在瞬间对大量细胞进行准确分析的特点，使其超越了传统的显微及化学分析技术，是一种测定基因组大小快速而有效的方法。流式细胞术在人和动物的临床和基础研究中被广泛应用，但是，由于植物体内含有大量的多糖、多酚等次生代谢物质，严重影响了PI染料的荧光染色强度，降低了测定基因组大小的准确性。因此明确适合测定物种流式细胞术的细胞核提取液及测定方法对该物种基因组大小研究至关重要。

CN104075983A中国专利公开了一种适用于苦苣苔科植物基因组大小的测定方法，CN107449717A中国专利公开了一种测定睡莲科植物基因组大小的方法，但这两件专利中的细胞核提取缓冲液用于胡椒属植物基因组大小时都不能形成完整的信号峰。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了细胞核提取缓冲液及胡椒属植物基因组大小的测定方法。该细胞核提取缓冲液能测定出40份胡椒属资源的基因组大小，且CV值都控制在误差范围内，提高了胡椒属植物信号峰的检出效率，提高了准确性。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：