[发明专利]一种荧光探针及其在pH值和氧化还原状态检测中的应用

权利要求书

1.一种荧光探针pACT-pHaROS，其特征在于，该探针利用绿色荧光蛋白iLOV和具有long-stokes位移的红色荧光蛋白mBeRFP制备而成，用于细胞内pH值和氧化还原状态的双重监测；所述荧光探针在应用时，利用绿色荧光蛋白iLOV的荧光变化检测氧化还原状态，利用红色荧光蛋白mBeRFP的荧光变化检测pH值；所述荧光探针具体通过如下步骤制备而成：

（1）构建含有iLOV基因序列的重组质粒pYES2-iLOV

以pGEX-iLOV为模板，PCR获得iLOV基因序列；然后对PCR扩增产物和pYES2质粒分别进行HindIII、BamHI双酶切，并将PCR扩增后的iLOV酶切产物进一步与pYES2连接重组，构建获得重组质粒pYES2-iLOV；

所述iLOV基因序列为：

ATGATAGAGAAGAATTTCGTCATCACTGATCCTAGGCTTCCCGATAATCCCATTATCTTTGCATCAGACGGCTTTCTTGAATTGACAGAGTATTCGCGCGAGGAAATATTGGGGAGAAATGCCCGGTTTCTTCAGGGGCCAGAGACAGATCAAGCGACTGTCCAGAAGATAAGAGACGCAATTAGAGATCAGAGGGAGACTACTGTGCAGTTGATAAACTACACTAAAAGCGGAAAGAAATTCTGGAACTTACTCCACCTGCAACCTGTGCGTGATCAGAAGGGAGAGCTTCAATACTTCATCGGTGTGCAGCTCGATGGAAGTGATCATGTA

（2）构建含有mBeRFP基因序列的重组载体pYES2-pHaROS

以pRSET-BeRFP为模板，PCR扩增获得mBeRFP基因序列；对PCR扩增产物进行EcoRI、XhoI双酶切，同时对步骤（1）中所构建的pYES2-iLOV质粒进行EcoRI和XhoI双酶切，再进一步对酶切产物进行连接重组，构建获得重组载体pYES2-pHaROS；

所述mBeRFP基因序列为：

ATGGTGTCTAAGGGCGAAGAGCTGATTAAGGAGAACATGCACATGAAGCTGTACATGGAGGGCACCGTGAACAACCACCACTTCAAGTGCACATCCGAGGGCGAAGGCAAGCCCTACGAGGGCACCCAGACCATGAGAATCAAGGTGGTCGAGGGCGGCCCTCTCCCCTTCGCCTTCGACATCCTGGCTACCAGCTTCATGTACGGCAGCAAGACCTTCATCAACCACACCCAGGGCATCCCCGACTTCTTTAAGCAGTCCTTCCCTGAGGGCTTCACATGGGAGAGATCCACCACATACGAAGACGGGGGCGTGCTGACCGCTACCCAGGACACCAGCCTCCAGGACGGCTGCCTCATCTACAACGTCAAGATCAGAGGGGTGAACTTCCCATCCAACGGCCCTGTGATGCAGAAGAAAACACTCGGCTGGGAGGCCAGCACCGAGATGCTGTACCCCGCTGACGGCGGCCTGGAAGGCAGAGACTACATGGCCCTGAAGCTCGTGGGCGGGGGCCACCTGATCTGCAACGCCAAGACCACATACAGATCCAAGAAACCCGCTAAGAACCTCAAGATGCCCGGCGTCTACTATGTGGACAGAAGACTGGAAAGAATCAAGGAGGCCGACAAAGAGACCTCCGTCGAGCAGCACGAGGTGGCTGTGGCCAGATACTGCGACCTCCCTAGCAAACTGGGGCACAAACTTAATTGA

（3）构建含有启动子pACT的pACT- pHaROS载体

将pYES2的诱导型启动子替换为稳定表达启动子pACT；具体而言：

对步骤（2）中所构建的pYES2-pHaROS载体进行SpeI、HindIII双酶切，与启动子pACT进行连接重组，构建获得重组的pACT-pHaROS载体；

所述启动子pACT序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：

AAAACCCTTAAAAACATATGCCTCACCCTAACATATTTTCCAATTAACCCTCAATATTTCTCTGTCACCCGGCCTCTATTTTCCATTTTCTTCTTTACCCGCCACGCGTTTTTTTCTTTCAAATTTTTTTCTTCCTTCTTCTTTTTCTTCCACGTCCTCTTGCATAAATAAATAAACCGTTTTGAAACCAAACTCGCCTCTCTCTCTCCTTTTTGAAATATTTTTGGGTTTGTTTGATCCTTTCCTTCCCAATCTCTCTTGTTTAATATATATTCATTTATATCACGCTCTCTTTTTATCTTCCTTTTTTTCCTCTCTCTTGTATTCTTCCTTCCCCTTTCTACTCAAACCAAGAAGAAAAAGAAAAGGTCAATCTTTGTTAAAGAATAGGATCTTCTACTACATCAGCTTTTAGATTTTTCACGCTTACTCTTTTTTCTTCCCAAGATCGAAAATTTACTGAATTAACA。