[发明专利]一种高效利用发根农杆菌诱导朱砂根产生毛状根的方法

权利要求书

1.一种高效利用发根农杆菌诱导朱砂根产生毛状根的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)发根农杆菌的活化：

A、将-80℃保存的发根农杆菌菌株在YMB固体培养基(含Amp 50mg·L^-1)上划线，于28℃恒温黑暗培养至长出单菌斑，挑单菌斑于YMB液体培养基(含Amp 50mg·L^-1)中，置于恒温振荡器中以180rpm、28℃恒温黑暗培养至液体浑浊；

B、重复进行2次上述A活化步骤中的划线、挑单菌斑、液体培养操作，共活化3次；在第3次活化进行液体培养时，于YMB液体培养基(含Amp 50mg·L^-1)中加入AS 100μmol·L^–1，测定菌液OD₆₀₀值至0.5～0.8时，即制备发根农杆菌感受态细胞，用于浸染介导转化；

2)朱砂根组培无菌叶片毛状根诱导：

包括预培养、共培养和除菌培养，将预培养后的朱砂根外植体叶片上表皮朝上水平接种在1/2MS固体培养基(含AS 100μmol·L^–1)上，于28℃恒温黑暗条件下共培养至叶片外植体周围略有菌斑，随后转接在除菌培养基(1/2MS+Cef)上除菌培养，反复继代抑制发根农杆菌增长至无菌，于25±1℃黑暗培养；

3)毛状根继代培养：当毛状根长至1～2cm时，切取毛状根转移至新的1/2MS培养基中继代培养。

2.根据权利要求1所述高效利用发根农杆菌诱导朱砂根产生毛状根的方法，其特征在于，所述的发根农杆菌菌株为ATCC 15834。

3.根据权利要求1所述高效利用发根农杆菌诱导朱砂根产生毛状根的方法，其特征在于，所述YMB液体培养基的配方为：酵母膏1g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、K₂HPO₄0.1 g、NaCl 0.1g、甘露醇10g，pH为7.2。

4.根据权利要求1所述高效利用发根农杆菌诱导朱砂根产生毛状根的方法，其特征在于，所述YMB固体培养基的配方为：酵母膏1g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、K₂HPO₄ 0.1g、NaCl 0.1g、甘露醇10g、琼脂12g·L^-1，pH为7.2。

5.根据权利要求1所述高效利用发根农杆菌诱导朱砂根产生毛状根的方法，其特征在于，步骤2)中所述外植体预培养过程为：将组培的朱砂根无菌苗叶片外植体剪成1cm²大小，在1/2MS培养基上预培养两天后，用活化好的菌液浸泡25～30min，伤口即为浸染切面，中途轻轻晃动，预培养后用无菌滤纸吸干外植体多余菌液。

6.根据权利要求1所述高效利用发根农杆菌诱导朱砂根产生毛状根的方法，其特征在于，步骤2)中所述除菌培养基每7d更换一次，除菌培养基中头孢噻肟钠Cef浓度按照100mg·L^-1·7d^-1依次递减，分别为500mg·L^-1、400mg·L^-1、300mg·L^-1、200mg·L^-1、100mg·L^-1、0mg·L^-1。

7.根据权利要求1所述高效利用发根农杆菌诱导朱砂根产生毛状根的方法，其特征在于，步骤2)中每次继代时均剔除污染、褐化、死亡外植体以及不具备离体自主生长的根系。

8.根据权利要求1所述高效利用发根农杆菌诱导朱砂根产生毛状根的方法，其特征在于，步骤2)中毛状根诱导的外植体与发根农杆菌共培养、除菌培养以及后续继代培养均在无激素培养基上进行。