[发明专利]百合花青素苷转运LhGST基因的克隆及其应用

权利要求书

1.百合花被片LhGST蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.编码权利要求1所述蛋白的百合花被片LhGST基因，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.编码权利要求1所述蛋白的百合花被片LhGST基因，其全基因序列如SEQ ID NO.2。

4.权利要求3所述的百合花被片LhGST基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)提取百合花被片RNA，反转录获得cDNA；

(2)根据转录组数据设计引物，以cDNA为模板，经PCR扩增，获得CDS序列，扩增CDS序列引物如下：

5’端引物：5’-CCAGGGCGGCGGAATGACACA-3’，

3’端引物：5’-TCGCAACCTACCTCAAGCTG-3’，

扩增出来的5’端和3’端序列经测序验证后与转录组序列对比，最终获得LhGST基因全长709bp的cDNA序列，如SEQ ID NO.1所示；

(3)根据获得的LhGST基因的CDS序列，设计了扩增DNA序列的引物，引物如下：

5’端引物：5’-ATGACACAAATGAAGACGGT-3’，

3’端引物：5’-TCGCAACCTACCTCAAGCTG-3’，

该基因的DNA序列全长为959bp，由3个外显子和2个内含子构成，如SEQ ID NO.2所示。

5.一种重组载体，其特征是含有权利要求2所述的百合花被片LhGST基因的cDNA序列。

6.根据权利要求5所述重组载体，命名为pCAMBIA3301-LhGST，其骨架载体为pCAMBIA3301。

7.根据权利要求6所述的重组载体的构建方法，为根据获得如SEQ ID NO.1所示的LhGST基因的CDS序列，设计在5’端和3’端引物分别加上16-25bp的接头序列，引物如下：

5’端引物：5’-CACGGGGGACTCTTGACCATGGCCAGGGCGGCGGAATGACACA-3’，

3’端引物：5’-GGGGAAATTCGAGCTGGTCACCTCGCAACCTACCTCAAGCTG-3’，

通过PCR扩增，获得带接头的CDS序列，利用同源重组的方法，将Nco I和BstE II双酶切载体pCAMBIA3301获得的线性载体片段与带接头的CDS序列进行重组，最终获得重组载体。

8.权利要求2所述的百合花被片LhGST基因沉默的方法，通过同源重组，将带有接头的SEQ ID NO.1所示的LhGST基因中167bp-487bp目的片段与被酶切后TRV₂线性载体连接，得到TRV₂-LhGST载体；将构建好TRV₂-LhGST载体转入农杆菌GV3101中，利用真空渗透法侵染百合花枝；培养7天后观察，被沉默花枝的花被片基部未观察到花青素苷斑点。

9.权利要求2所述的百合花被片LhGST基因在百合花色分子育种中的应用。