[发明专利]可实时、动态观察纤维素酶时空定位和分泌的里氏木霉重组荧光菌株

说明书

本发明涉及可实时、动态观察纤维素酶时空定位和分泌的里氏木霉重组荧光菌株，本发明涉及基因工程及生物技术领域，以里氏木霉RUT‑C30为出发菌株成功构建了里氏木霉工程菌株RBGL、RCBH和RCMC，分别表达红色荧光蛋白DsRed标记的纤维素酶BGL、CBH和CMC；本发明首次以直观、动态方式可视化了活体里氏木霉中纤维素酶的时空分布和分泌情况，为揭示里氏木霉中纤维素酶的分泌途径提供了新的研究手段；荧光结果表明，重组菌株中BGL、CBH和CMC定位于真菌整个菌丝体中，并在液泡和细胞膜、细胞壁积累。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及可实时、动态地追踪里氏木霉中纤维素酶的时空定位和分泌途径的三种重组荧光菌株RBGL、RCBH和RCMC。

背景技术

丝状真菌具有高效的蛋白质分泌能力，并广泛用于工业酶的生产(TrendsBiotechnol. 2002；20:200-6.)。例如木霉属(Appl Environ Microbiol.2016；82:6247-57)、曲霉属(Microbiol Res. 2010；165:516-22)和青霉属(Tetrahedron.2005；61:7252-65)等，具有出色的纤维素酶或半纤维素酶分泌能力，可有效降解植物生物质中的纤维素、半纤维素、果胶、木质素等难降解聚合物(Nat.Biotechnol.2008；26:553-560)。然而，关于分泌途径、翻译后修饰以及纤维素酶自菌丝分泌到培养基中这一释放过程的分子机制仍然未知。丝状真菌的蛋白质分泌可以通过穿过内膜系统的常规途径，也可以通过非常规分泌途径进行。与其他真核细胞一样，丝状真菌的经典分泌途径是内质网-高尔基通路。蛋白质首先进入内质网进行折叠，通过糖基化、二硫键形成、磷酸化和亚基组装进行修饰，然后被包装到运输囊泡中以递送到高尔基体。一旦进入高尔基体，蛋白质通过添加和/或去除特定的糖残基而进一步糖基化，然后再次包装在分泌囊泡中，并定向到液泡系统或者胞质膜进行胞吐作用。在丝状真菌中，胞吐主要发生在生长的菌丝顶端，在那里高尔基体和内质网室大量积累(Curr OpinMicrobiol.2014；20:1-9)。然而，在真菌细胞的其他部位，如隔膜(MolMicrobiology.2011；81:40-55)和侧质膜(Biotechnol Lett.2008；30:7-14)也有胞吐现象。除了传统的转运途径外，真菌蛋白质分泌的非传统转运途径也曾被报道过。Stock等称，美黑穗病菌的几丁质酶分泌是通过非常规的分泌途径，独立于内质网和高尔基体样结构(J Biotechnol.2012；161:80-91)。

里氏木霉具有显著的纤维素酶分泌能力，细胞外纤维素酶可达100g/L(CurrOpinBiotech. 2003；14:438-443)，因此受到人们的特别关注。同时，它是用于研究纤维素酶产生和分泌机制的模式生物，也是用于产生异源蛋白质的有吸引力的宿主。里氏木霉产的纤维素酶主要包括三种：β-葡萄糖苷酶(BGL)、外切葡聚糖酶(CBH)和羧甲基纤维素酶(CMC)。电镜分析里氏木霉RUT-C30和QM6a中内质网结构是对里氏木霉蛋白分泌途径的最早研究(Enzyme Microb Technol.1982；4:110-113)。后来致力于分泌过程的成像和动力学测量、分泌通路成分的分子表征和相关转录调控的研究。通过测定纤维素酶在亚细胞分离、电子显微镜和免疫电子显微镜下(Arch Microbiol.1993；159:417-422)的酶活性，研究了纤维素酶的定位和分泌。然而，荧光显微镜结合荧光蛋白融合这一方法尚未被用于研究纤维素酶的时空分布和分泌，这是一种能够提供直观、清晰的可视化的强大策略。

本研究成功地将BGL、CBH和CMC三种主要纤维素酶组分与荧光蛋白DsRed在里氏木霉RUT-C30中融合表达，得到重组菌株RBGL、RCBH和RCMC。这使得利用共聚焦激光扫描显微镜和荧光酶标仪可视化活体里氏木霉中纤维素酶的时空分布和分泌情况成为现实。本研究还利用该方法成功探索了纤维素酶产生的动力学过程和BFA对纤维素酶产生的影响。

发明内容