[发明专利]利用二重实时荧光定量RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的方法

权利要求书

1.用于猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的二重实时荧光定量RT-PCR检测的引物组，其特征在于，所述引物组包含2对特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-4所示。

2.与权利要求1所述的引物组配套使用的探针组，其特征在于，所述探针组包含2条探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5-6所示。

3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于，所述探针的5’端标记的荧光基团为选自FAM、HEX、CY5、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记的淬灭基团为选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

4.权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的探针组在制备用于猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒检测的试剂盒中的应用。

5.一种猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的引物组；

优选地，所述检测试剂盒还包含权利要求2或3所述的探针组。

6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包含一步法RT-PCR反应液、酶混合液、无核酸酶纯化水、阳性对照和阴性对照中的一种或多种。

7.根据权利要求5或6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒在工作时的反应程序如下：50℃ 10min；95℃、2min；95℃、5s，57℃、10s，72℃、10s，采集荧光信号，40个循环；

所述检测试剂盒在工作时的25μL反应体系如下：2×RT-PCR反应液12.5μL，酶混合液1μL，引物探针混合液1μL，待检测RNA模板2μL、无核酸酶纯化水8.5μL；

所述引物探针混合液包含10μM引物混合液和5μM探针混合液；所述酶混合液包含逆转录酶和DNA聚合酶。

8.一种猪流行性腹泻病毒和B型猪肠道病毒的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法，其特征在于，包括：提取待测样品中的病毒RNA，以所述病毒RNA为模板，利用权利要求1所述的引物组和权利要求2或3所述的探针组，或者利用权利要求5或6所述的检测试剂盒进行二重实时荧光定量RT-PCR检测，根据扩增曲线和/或Ct值判断检测结果。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述二重实时荧光定量RT-PCR的反应程序如下：50℃ 10min；95℃、2min；95℃、5s，57℃、10s，72℃、10s，采集荧光信号，40个循环。

10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于，所述二重实时荧光定量RT-PCR的反应体系如下：2×RT-PCR反应液12.5μL，酶混合液1μL，引物探针混合液1μL，待检测RNA模板2μL、无核酸酶纯化水8.5μL；

所述引物探针混合液包含10μM引物混合液和5μM探针混合液；所述酶混合液包含逆转录酶和DNA聚合酶。