[发明专利]一种CRISPR诱导RNA文库设计方法

说明书

本发明公开了一种CRISPR诱导RNA文库设计方法，包括以下步骤：步骤一、根据参考基因组生成kmer集合；步骤二、将kmer切分成kmer1和kmer2两部分，将对应的kmer1相同的kmer2分成一个类别；再将同一类别的kmer2构建到同一个检索树中，各检索树的键序列为其中kmer2对应的kmer1；步骤三、并行获取诱导RNA及其脱靶序列，该步骤中，在比对一个kmer与检索树的键序列和其中的kme2连接成的kmer时，首先将该kmer的kmer1与检索树的键序列比对，看是否满足设定条件，满足则继续比对kmer的kmer2与检索树中的kmer2。本发明提高了计算效率。

技术领域

本发明属于功能基因组学领域，具体涉及一种CRISPR诱导RNA文库设计方法。

背景技术

在当前一代的基因组编辑技术中，CRISPR系统(Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats成簇的规律间隔的短回文重复序列)与Cas9核酸酶(与CRISPR关联的RNA引导核酸酶9)的技术研究发展最快，其可以很容易地靶向几乎任何基因组位置，为基因工程的创新发展迈出了一大步。来自CRISPR系统的Cas9蛋白通过利用诱导RNA(guide RNA，gRNA，也称为向导RNA)与DNA靶序列碱基互补配对的特点将诱导RNA与蛋白的复合体定位到DNA靶序列。与目标位置下游的原间隔相邻基序(PAM)的结合有助于指导Cas9切割DNA双链，PAM是Cas9核酸酶切割DNA双链所必需的。其中诱导RNA是CRISPR-Cas系统的关键构件，由不变部分和可变部分组成，可变部分是与DNA靶序列互补的部分，可以通过人工设计可变部分实现诱导RNA与DNA不同位点的结合。CRISPR诱导RNA文库对于基因组编辑系统至关重要。随着基因组测序技术的进步，诱导RNA文库的设计对于理解基因组功能变得越来越重要。

目前已经开发了许多诱导RNA设计工具，例如CRISPR Design，Cas-OFFinder，CRISPRscan和E-CRISP，用于基因组编辑。然而，这些工具返回了独特但有重叠的诱导RNA集合，还忽略了全基因组非编码区，而且使用第三方比对工具进行脱靶序列搜索。

最近，GuideScan软件改进了CRISPER诱导RNA数据库的构建。GuideScan是一个开源系统，可以从任何基因组或CRISPR核酸内切酶设计更多合成或完全定制的诱导RNA文库。此外，GuideScan软件还可以构建单引物RNA和双引物RNA数据库，且能够获得相当多的具有多个完美目标位点的诱导RNA。因此，GuideScan获得的诱导RNA比其他工具平均获得的诱导RNA具有更高的特异性。然而，GuideScan的计算成本比较高，尤其当计算诱导RNA的脱靶序列(与诱导RNA错配数不小于参数M且不大于参数Q，Q＞M)时，GuideScan的计算成本非常高。因此，将GuideScan应用于大型基因组是不切实际的。随着越来越多的真核基因组被测序或重新测序，需要更有效的工具来加速CRISPR诱导RNA文库的设计。

发明内容

本发明的目的是提供一种CRISPR诱导RNA文库设计方法，有效降低设计CRISPR诱导RNA文库的计算时间开销。

一种CRISPR诱导RNA文库设计方法，包括以下步骤：

步骤一、在参考基因组中扫描以标准PAM或者非标准PAM为前缀或后缀的kmer，构成kmer集合，即可靶向的基因组空间；

步骤二、对kmer集合中的每一个kmer，将其切分成kmer1和kmer2两部分，其中kmer1为其前n个碱基组成的序列，将对应的kmer1相同的kmer2分成一个类别，将一个类别的kmer2对应的kmer1作为该类别kmer2的键序列；再将同一类别的kmer2构建到同一个检索树(字典树)中，由此多个检索树(数据任务分成一系列的小任务)，每个检索树的键序列为相应类别的kmer2的键序列；