[发明专利]一种通过敲除rfaD基因高效合成PHB的方法

说明书

本发明公开了一种通过敲除rfaD基因高效合成PHB的方法，属于基因工程和发酵工程领域。本发明敲除大肠杆菌基因组上rfaD基因后将合成PHB的酶的编码基因转化到菌株中发酵生产PHB。发现rfaD基因的敲除可以显著改善大肠杆菌W3110、DH5α和JM109合成PHB的能力，WJW00/pDXW‑8‑phaCAB的PHB体积产量较对照菌W3110/pDXW‑8‑phaCAB提高3.95和3.66倍；WJD00/pDXW‑8‑phaCAB细胞合成PHB占细胞干重比例较对照菌提高约80％，转化率提高约1.9倍；WJJ00/pDXW‑8‑phaCAB细胞合成PHB占细胞干重比例较对照菌提高约75％，转化率提高约1.8倍。

技术领域

本发明涉及一种通过敲除rfaD基因高效合成PHB的方法，属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由微生物合成的可再生可降解且具有多元材料学性能的高分子聚合物，在医学、材料和环保领域有着广泛的应用前景。聚羟基脂肪酸酯广泛存在于微生物细胞内，主要作为碳源及能量的贮存载体。生长环境C:N比例越高，越有利于PHA的合成。PHA在胞内以疏水性颗粒的形式存在，在特定条件下其含量可以超过细胞干重的90％。PHA根据单体种类、聚合方式的不同，具有从坚硬质脆的硬塑料到柔软的弹性体等一系列多样性的材料学特性。由于PHA可由可再生资源为原料合成，进入自然界后可以被细菌等生物完全降解，替代常规石油基塑料可以缓解严重的“白色污染”问题，从而引起世界各国科学界和工业界的广泛重视。

聚3-羟基丁酸酯(PHB)是PHA中的一种，大肠杆菌常用于PHB的工业生产。PHB是一种胞内产物，PHB颗粒是胞内的碳源储存物质，以不溶性微球状颗粒状形式存在于细胞质中。PHB合成受到很多调控，如C:N比例，当碳过剩、氮缺乏时，PHB更易合成，当胞内其他C源代谢旺盛时，或者氨基酸转运酶活低时，PHB合成会受到影响。大肠杆菌合成PHB的关键在于平衡产物和细胞生长，既要使得细胞生长好，又要增强其合成途径的代谢流，并通过控制产物形成途径的表达水平来提高产量。现有报道中主要通过优化发酵条件、优化代谢途径、提高胞内辅酶浓度和优化表达质粒等手段来改善PHB的合成。但是这些方法使得PHB产量的提高仍然无法满足工业上生产的需求。因此，提供一种新的提高PHB合成的方法，对于进一步提高PHB的合成具有十分重大的意义。

发明内容

为了解决上述存在的技术问题，本发明敲除大肠杆菌基因组上rfaD(又名gmhD)基因，并将PHB合成基因簇phaCAB转化到菌株中得到重组菌后，利用重组菌进行发酵生产PHB，意外的发现rfaD基因的敲除可以显著改善大肠杆菌合成PHB的能力，PHB体积产量是野生对照菌的3.95倍。

本发明的第一个目的是提供一种高效合成聚3-羟基丁酸酯(PHB)的方法，所述方法是敲除大肠杆菌基因组上ADP-L-甘油-D-甘露-庚糖-6-差向异构酶RfaD基因，并将β-酮基硫解酶，乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶的编码基因转化到菌株中得到重组菌后，利用重组菌进行发酵生产。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌W3110、大肠杆菌DH5α或大肠杆菌JM109。

在一种实施方式中，所述ADP-L-甘油-D-甘露-庚糖-6-差向异构酶RfaD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在一种实施方式中，所述β-酮基硫解酶的protein ID为QBK40993.1；所述乙酰辅酶A还原酶的protein ID为QBK40994.1；所述PHB合成酶的protein ID为QBK40992.1。

在一种实施方式中，所述转化是将基因连接到质粒pDXW-8上，然后转化到细胞中。