[发明专利]一种特异性识别蛋白PRM2的多克隆抗体制备方法及其应用

说明书

本发明涉及生物科学和检测试剂技术领域，具体公开了一种特异性识别蛋白PRM2的多克隆抗体制备方法及其应用，包括如下步骤：(1)蛋白PRM2抗原表位分析：通过抗原表位分析选择目的片段用作蛋白PRM2的重组表达，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ ID N0.1所示，在上、下游引物分别引入BamH1、Not I酶切位点。本发明实现PRM2的多克隆抗体的制备。

技术领域

本发明涉及生物科学和检测试剂技术领域。

背景技术

不孕不育问题一直是人类生殖研究中的重要课题。现世界上越有15％的夫妇受此困扰，其中约有一半是男方原因。为寻求不孕不育解决方案，对其机制的研究必不可少。

在脊椎类动物精子发生的单倍体阶段，鱼精蛋白替代精子染色质中的组蛋白，成为精子细胞核中主要的DNA结合蛋白。在鱼精蛋白帮助下，DNA双链进行一系列的盘绕、折叠、压缩，形成高密度的染色体，其体积小于体细胞核的5％。大多哺乳动物只有一种鱼精蛋白(鱼精蛋白1)；然而，包括人类和老鼠在内的一些物种有两种鱼精蛋白：鱼精蛋白1和鱼精蛋白2(PRM2，protamine 2)。研究示未成熟精子中的PRM2处于低表达水平，这或许与精子的形态学异常，细胞凋亡途径启动和精子活力的降低有关(参考文献：Zalata,A.A.andN.Mokhtar,et al.(2016).The Role of Protamine 2Gene Expression and Caspase9Activity in Male Infertility.J Urol 195(3):796-800.Zalata and Mokhtar etal.,2016)。同时，对基因敲除鼠的研究示小鼠可以耐受单个PRM2等位基因丢失，即杂合子雄性小鼠保持有生育能力，而PRM2缺陷的小鼠精子异常不能生育(参考文献：Morimoto,K.and M.Hijikata,et al.(2019).Recurring large deletion in DRC1(CCDC164)identified as causing primary ciliary dyskinesia in two Asian patients.MolGenet Genomic Med:e838.)。

然而现有技术中关于蛋白PRM2多克隆抗体制备方法的相关研究还是处于空白阶段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性识别蛋白PRM2的多克隆抗体制备方法，以实现PRM2的多克隆抗体的制备。

为了达到上述目的，本发明的基础方案提供一种特异性识别蛋白PRM2的多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)蛋白PRM2抗原表位分析：通过抗原表位分析选择目的片段用作蛋白PRM2的重组表达，所述目的片段的基因序列如序列表中SEQ ID N0.1所示，在上、下游引物分别引入BamH1、Not I酶切位点及同源臂；

(2)提取小鼠正常睾丸组织mRNA，并以其作为模板进行反转录PCR，合成cDNA第一链然后以此为模板，进行PCR扩增；

(3)扩增的PCR产物经纯化后，将PCR产物PRM2DNA目的片段前后分别引入BamH1与NotI酶切位点及同源臂，并与用BamH 1和Not 1切开的的pET28a在TDNA连接酶的作用下进行连接；

(4)连接产物转化入感受态菌BL21，挑选阳性克隆，提取质粒，经双酶切鉴定后测序，将测序正确的克隆抽提质粒，并转入BL21菌株，IPTG诱导表达，表达的目的蛋白经Ni柱纯化后，得到目的蛋白PRM2；

(5)将步骤(4)的目的蛋白PRM2在N端添加半胱氨酸Cys标签，然后与载体蛋白KLH偶联作为抗原免疫小鼠，完成免疫周期；

(6)以细胞株的细胞通过小鼠生产，而获得特异性识别蛋白PRM2多克隆抗体。