[发明专利]SVA、FMDV、SVDV和VSV的一步法多重实时荧光定量PCR检测引物和探针

说明书

本发明公开了一种SVA、FMDV、SVDV和VSV的一步法多重实时荧光定量PCR检测引物和探针，属于生物技术检测领域。并基于提供的引物和探针开发出了用于同时检测SVA、FMDV、SVDV和VSV的试剂盒。本发明提供的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、敏感性高、重复性好，可以实现对SVA、FMDV、SVDV和VSV同时准确定性和定量检测，将在SVA、FMDV、SVDV和VSV的检测及疫苗生产、例如疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗中发挥重要作用，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域中的兽医动物病原检测，涉及一种对SVA、FMDV、SVDV 和VSV进行定性、定量检测的一步法多重实时荧光定量PCR检测引物和TaqMan探针，尤其涉及一种对SVA、FMDV、SVDV和VSV进行定性、定量检测的一步法多重实时荧光定量 PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针。

背景技术

口蹄疫病毒(FMDV)、塞内卡病毒(SVA)、猪水疱病病毒(SVDV)和水泡性口炎病毒(VSV)同属于微RNA病毒科。塞内卡病毒是塞内卡病毒属的典型代表，与心病毒属最接近，口蹄疫病毒属于口疮病毒属，猪水疱病病毒属于肠道病毒属，水泡性口炎病毒属于水泡病毒属。口蹄疫、猪水疱病和水泡性口炎都是猪的重要病毒性传染病，塞内卡病是最近几年发现的一种猪的传染病，该四种病毒传染病都是以鼻部、口部和蹄部的冠状带部可见水疱症状，其临床特征极为相似，肉眼无法鉴别。口蹄疫、水疱性口炎和猪水泡病这三种疾病被OIE 列为A类传染病,不但严重影响了畜牧业的发展，而且对人体健康也存在着极大的威胁，是世界各国检疫和防疫的重点对象。塞内卡病毒首次于2002年在美国马里兰州的一家公司发现， 2007年，一批从加拿大运往美国明尼苏达州的猪鼻镜出现水泡、蹄部冠状带溃烂等类似水疱病症状，经检测排除口蹄疫、水泡性口炎病和猪水疱病，最终通过PCR检测确定为塞内卡病毒阳性。从2014年至今，在美国、中国、加拿大、巴西、泰国、哥伦比亚等多国均发现SVA 病毒导致的临床病例。在2007年之前，SVA主要作为溶瘤细胞被研究，可有效治疗一些神经内分泌肿瘤。口蹄疫、水疱性口炎和猪水泡病为牛、猪和羊等偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病，以口腔黏膜、舌面、唇、鼻镜、蹄部和乳房皮肤发生水疱和溃烂为特征。这四种传染病的临床特征及病理变化都十分相似，临床上很难区分，需采取水泡液、水泡皮、痂皮和血清等送往实验室使用常规的病原学和血清学检测方法进行鉴别诊断。但使用常规的病原学和血清学检测方法，不但耗时长，而且过程繁琐，目前还没有对SVA、FMDV、 SVDV和VSV同时进行快速鉴别检测的方法。

制备灭活疫苗是预防病毒流行的最有效措施，灭活疫苗中的抗原水平在传染病的预防中发挥着重要作用。灭活疫苗的制备主要通过将病毒进行体外培养后灭活得到病毒液，然后与乳化剂混合制成免疫疫苗。在制备疫苗的过程中，例如在制备多价疫苗时，准确、特异、快速地检疫苗中病毒抗原的水平在疫苗生产监控、评价疫苗质量以及指导疫苗用量等方面具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明一个方面提供一种用于对SVA、FMDV、SVDV和VSV进行多重实时荧光定量PCR检测的引物和Taqman探针，其中用于检测SVA的上游引物(SVA1-F)和下游引物(SVA1-R)，所述上游引物(SVA1-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：5所示，下游引物(SVA1-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示；

用于对SVA进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(SVA1-P)，所述TaqMan探针(SVA1-P)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：7所示；

用于检测FMDV的上游引物(FMDV1-F)和下游引物(FMDV1-R)，所述上游引物(FMDV1-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：8所示，下游引物(FMDV1-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：9所示；